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ISSN : 1225-4339(Print)
ISSN : 2287-4992(Online)
The Korean Journal of Food And Nutrition Vol.26 No.1 pp.66-77
DOI : https://doi.org/10.9799/ksfan.2013.26.1.066

Monascus pilosus 발효 뽕잎차가 고지방 식이 마우스의 체중과 간 조직 항산화계 효소 활성에 미치는 영향

이상일, 이예경*, 이인애*, 최종근**, 김순동*, 서주원*
계명문화대학교 식품영양조리학부, *명지대학교 생명과학정보학부, **청운대학교 화장품과학과

Effects of Mulberry Leaf Tea Fermented by Monascus pilosus on Body Weight and Hepatic Antioxidant Enzyme Activities in Mouse Fed High-Fat Diet

Joo-Won Suh*, Sang-Il Lee, Ye-Kyung Lee*, In-Ae Lee*, Jongkeun Choi**, Soon-Dong Kim*
*Division of Bioscience and Bioinformatics, Myongji University, Yongin 449-728, Korea
Dept. of Food, Nutrition and Culinary Arts, Keimyung College, Daegu 704-703, Korea
**Dept. of Cosmetic Science, Chungwoon University, Chungnam 350-701, Korea

Abstract

In this study, we investigated the preventive effects of the mulberry leaf tea fermented by Monascus pilosus on highfat-induced obesity, hyperlipidemia, and fatty liver in mice. Non-fermented mulberry leaf tea powder (UM) and fermentedmulberry leaf tea powder (FM) were supplemented with high-fat diet at 2% (wt/wt) dosage for 8 weeks. Both UM andFM lowered body weight gain, feed efficiency ratio, epididymal fat, serum triglyceride, total cholesterol and LDL-cholesterolincreased markedly with high fat diet (HC) in mice. FM showed more significant effects when it was compared with UM.In addition, Hepatic lipid peroxides and xanthin oxidase activities of the UM and FM were significantly lower than thoseof HC, despite the lack of a big difference in the amount of hepatic GSH. Activities of ROS scavenging enzymes andserum alanine aminotransferase activity were also examined as a parameter of hepatic damage. The UM and FM groupsshowed a recovery to NC group from significant changes induced by HC. Finally, histopathological analyses of liver samplesrevealed a decrease of lipid accumulation in hepatocytes in the UM and FM groups. These results suggest that UM andespecially FM can reduce the development of obesity, hyperlipidemia and fatty liver.

10_이상일외.pdf3.35MB

서 론

뽕나무(Morus alba)는 뽕나무과에 속하는 교목성 낙엽수로 73속 1,000여종이 있으며, 우리나라에는 5속 13종이 분포하고, 유전자원으로 등록된 계통수는 장려품종, 육성계통 및 수집자원을 합해서 615계통이 있으며, 대부분이 수집자원으로 알려져 있다(Kim 등 2007). 과거 뽕잎은 주로 양잠산업용 누에의 먹이로 이용해 왔으나, 양잠산업이 활기를 잃자 뽕잎, 열매, 껍질 및 뿌리 등을 식․의약용 소재로 활용하기 위한 연구들이 활발하게 진행되고 있으며(Kim 등 2010), 특히, 뽕잎에 함유된 다양한 생리활성물질을 활용하기 위한 연구들이 많이 이루어지고 있다(Hansawasdi & Kawabata 2006). 특히, 뽕잎은 γ-aminobutyric acid와 rutin의 함량이 높고, 노인성 치매와 동맥경화를 예방하며(Chae 등 2003), 항암, 항염, 항산화, 항고지혈증 및 혈압조절에 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Park 등 2005). 뽕잎차는 주로 뽕잎을 증기로 쪄서 말린 증차와 고열로 덖어낸 덖음차로 제조되고 있다(Kim 등 2010). 그러나 최근 식물의 잎을 phytoenzyme 또는 특정한 미생물을 사용하여 발효시킴으로써 세포벽에 결합된 기능성 성분들의 추출수율을 높임과 동시에 식물체가 가지는 유해성분을 분해시켜 제거하며, 또한 발효에 의한 새로운 기능성 성분들이 생성됨으로써 기존의 차에 비하여 고품질의 차를 생산할 수 있어 이에 대한 관심이 증대되고 있다(Bae & Ye 2010; Kang OJ 2010).

한편, Monascus속 곰팡이는 아시아 여러 나라에서 홍국의 제조, 식품의 보존과 질병 치료(Ma 등 2000)에 이용하고 있으며, cholesterol 생합성을 저해하는 monacolin K과 같은 statin계 성분을 생합성 함으로써 동맥경화의 예방과 골 형성 촉진 효과가 있는 것으로 보고되고 있다(Choi & Yu 2004). 또한 monacolin K은 항진균, 항당뇨, 항고혈압, 항콜레스테롤 및 항암 등의 효과가 있으며, 홍국의 rubropuntain, monascorubin, monascin, ankaflavin, rubropunctamine 및 monascorubramine 등의 색소 성분은 항균 및 항암 효과가 알려져 있다(Kang 등 2008). 

최근 본 연구자들은 Monascus속 미생물을 액체배양하여 얻은 균사체의 ethanol 추출물이 고지방 식이로 유도한 비만 흰쥐에서 항비만 효과(Lee 등 2011a)와 비만으로 손상된 간의 기능을 증진시키는 효과를 관찰한 바 있다(Lee 등 2011b). 또, Monascus pilosus로 발효시킨 뽕잎차의 품질특성과 항산화 활성능을 보고한 바 있다(Lee 등 2012). 본 연구에서는 M. pilosus로 발효시킨 뽕잎차가 고지방 식이 마우스의 체중과 혈청지질 함량 및 간 조직 항산화계 주요 효소 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 

재료 및 방법

1. 재료 및 균주

실험용 뽕잎(M. alba leaves)은 2011년 6월에 경북 경산시 남산면 안심리에서 채취한 것을 사용하였으며, 균주는 한국종균협회에서 분양받은 M. pilosus IFO 4480을 사용하였다. 

2. 뽕잎의 발효

뽕잎의 발효는 생 뽕잎을 1×2 ㎝ 크기로 자른 후 40℃에서 2일간 건조시켰으며(unfermented mulberry leaves: UF), 발효는 건조시킨 뽕잎에 물을 가하여 총 수분 함량이 30%가 되게 조절한 후 2ℓ들이 polypropylene bag에 300 g씩 넣고 air filter를 부착하여 121℃에서 90분간 살균하였다. 살균시킨 뽕잎에 미리 준비한 M. pilosus 배양액 50 ㎖를 접종하여 30℃에서 15일간 배양한 다음, 40℃에서 수분 함량이 2% 내외가 되도록 건조시킨 후 1.5 ㎜ 체로 쳐서 발효 뽕잎차를 제조하였다(Fig. 1). M. pilosus 배양액은 glucose(5%), peptone(2%), KH2PO4(0.8%), MgSO4․7H2O(0.05%), CH3COOK(0.2%), NaCl(0.1%)을 함유하는 배지에 균주를 접종하여 150 rpm의 진탕배양기에서 10일간 배양하여 사용하였다. 

Fig. 1. Preparation procedure of mulberry leaves tea fermented by M. pilosus.

3. 동물실험

실험동물은 4주령의 평균체중 21∼24 g의 ICR(Crljori: CD-1), SPF/VAF outbred mice(Orient Ltd., Sungnamsi, Korea)를 basic pellet chew인 5L79 diets(PMI Nutrition, LLC, Brentwood, MO, USA)로 1주일간 사육하여 환경에 적응시킨 다음 실험에 사용하였다. 동물실험은 고지방 식이 mouse에 미치는 발효 뽕잎차의 영향을 검토하기 위하여 basic pellet chew(5L79 diets, PMI Nutrition, LLC, Brentwood, MO, USA)만을 급여한 정상 식이군(NC), basic pellet chew에 lard를 35% 혼합한 고지방 식이 대조군(HC), basic pellet chew에 lard 35%와 UM 분말을 2% 혼합한 식이군(UM) 및 basic pellet chew에 lard 35%와 FM 분말을 2% 혼합한 식이군(FM) 등 4개 군으로 나누어 실험하였다(Table 1). 실험식이는 전문제조회사인 Feeds Lab(Guri-si, Gyeonggi-do, Korea)에 의뢰하여 제조한 후 4℃에서 보관하면서 매일 신선한 식이를 공급하였다. 실험동물은 stainless steel cage에 넣어 사육하였고, 온도 및 습도는 23±2℃, 60±5%로 조정하였으며, 명암주기는 12시간 간격으로 설정하였고, 음용수 및 사료는 자유 섭취시켰다.

Table 1. Experimental groups and ingredients of diets

4. 식이섭취량, 체중증가량 및 식이효율 측정

체중과 식이섭취량은 전 실험기간 동안 매일 일정시간에 측정하였으며, 식이효율(feed efficiency ratio, FER)은 1주간의 체중증가량을 1주간의 식이섭취량으로 나눈 값으로 하였다. 

5. 혈청 ALT 활성 및 지질 함량

혈청 ALT(alanine aminotransferase) 활성도는 Reitman과 Freanke (1957)의 방법에 준하여 kit 시약(Asanpharm Co. Ltd., Korea)을 사용하여 측정하였으며, 혈청 1 ㎖당 분당 NADH의 흡광도를 0.001 감소시키는 Karmen unit로 나타내었다. 혈청 중성지질, 총 콜레스테롤 및 HDL-콜레스테롤 함량은 kit 시약(AM 157S-K, AM 202-K, AM 203-K, Asanpharm Co. Ltd., Korea)으로 측정하였으며, LDL-콜레스테롤 함량은 Friedewald 등(1972)의 방법에 따라 계산하였다. Atherogenic index(AI)는 계산식[(total cholesterol−HDL-cholesterol)/HDL-cholesterol]에 의하여 산출하였다. 

6. 효소 활성 측정 시료 준비

8주간 사육한 mice는 물만 주고 12시간 동안 금식시킨 후 ether 마취 하에서 하대정맥으로부터 채혈한 다음, 빙냉의 생리식염수로 간을 관류하고, 장기를 적출한 후 수분을 제거하고 무게를 측정하였다. 적출한 간 조직 일정량에 4배량의 0.25M sucrose 용액을 가하여 마쇄한 균질액을 10,000×g(4℃)에서 30분간 원심분리한 다음 postmitochondrial fraction을 취해 효소 활성도 측정에 이용하였다. 채취한 혈액은 실온에서 응고 시킨 다음 4℃, 2,500×g에서 10분간 원심분리하여 혈청을 분리한 후, −70℃에 두면서 분석용 시료로 사용하였다. 

7. 간 조직 지질 함량

Folch & Less(1957)의 방법에 따라 chloroform과 methanol (2:1) 혼합액에 간 조직 마쇄액 일정량을 가해 잘 혼합한 다음 방치하여 분리된 유기용매 부분 일정량을 취해 질소가스 존재 하에서 휘발시킨 후 중성지방의 함량과 총 콜레스테롤의 함량을 kit 시약(AM 157S-K, AM 202-K, Asanpharm Co. Ltd., Korea)으로 각각 측정하였다. 

8. 간 조직 GSH 및 LPO의 함량 측정

간 조직 환원형 glutathione(GSH)의 함량은 Ellman(1959)의 방법에 따라 일정량의 간 조직 마쇄균질액에 5,5'-dithibis(2-nitrobenzoic acid)를 가하여 생성되는 thiophenol의 흡광도를 측정하였으며, 간 조직 g당 GSH μmole로 나타내었다. Lipid peroxide(LPO)의 함량은 Ohkawa 등(1979)의 방법에 따라 일정량의 간 조직 마쇄균질액에 thiobarbituric acid(TBA) 용액을 가하여 반응시킨 후 n-butanol을 가하여 이행되는 TBA-reactive substance를 흡광도 532 nm에서 측정한 다음 분자흡광계수(ε=1.5×105M-1-1)를 이용하여 함량을 산출하였으며, 간 조직 g 당 malondialdehyde(MDA) nmole로 나타내었다. 

9. 간 조직 XO, SOD, GST 및 GPX 활성의 측정

간 조직 xanthine oxidase(XO)의 활성은 Stirpe & Della Corte (1969)의 방법에 따라 측정하였으며, 활성도는 분당 단백 1 ㎎이 기질인 xanthine으로부터 생성시킨 uric acid의 양을 nmole로 나타내었다. Superoxide dismutase(SOD) 활성은 Martin 등(1987)의 방법에 따라 superoxide anion radical에 의해 hematoxylin으로부터 생성되는 hematin을 560 nm에서 측정하였으며, 효소원을 가하지 않은 대조구의 흡광도를 50% 억제하는 효소량을 1 unit로 하여 1 ㎎의 단백질이 hematoxylin의 자동산화를 억제하는 정도를 U(Unit)로 나타내었다. Glutathione S-transferase(GST) 활성은 Habig 등(1974)의 방법에 따라 효소에 의해 기질인 1-chloro-2,4-dinitrobezene과 GSH이 반응하여 생성되는 thioether의 흡광도를 340 nm에서 측정한 다음 흡광계수(ε=9.5 M−1−1)를 이용하여 활성도를 계산하였으며, 분당 단백질 1 ㎎이 생성시킨 thioether의 μmole로 나타내었다. Glutathione peroxidase(GPX) 활성은 Paglia & Valentine(1967)의 방법에 따라 1 mM EDTA 함유 50 mM phosphate buffer(pH 7.0) 용액 일정량에 1 mM sodium azide, 0.2 mM NADPH, 1 mM GSH, 1 unit glutathione reductase 및 일정량의 효소원과 기질인 0.25 mM hydrogen peroxide를 가해 25℃에서 반응시키는 동안에 생성된 oxidized glutathione을 환원시키는데 소모된 NADPH를 340 nm에서 측정하고, 분자흡광계수(ε=6.22 mM−1−1)를 이용하여 효소 활성을 계산하였다. 효소의 활성도는 1 ㎎의 단백질이 1분간 산화시킨 NADPH의 함량을 nmole로 나타내었다.

10. 단백질 측정

간 조직의 단백질 함량은 Lowry 등(1951)의 방법에 따라 bovine serum albumin(BSA)을 표준용액으로 하여 측정하였다.

11. 간 조직 검사

8주간 사육한 흰쥐 간 조직을 절취하여 10% neutral formalin에 고정시킨 다음, 알코올 탈수, 파라핀 포매하여 microtome으로 4 ㎛ 두께로 잘라 hematoxylin과 eosin으로 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다. 

12. 통계 처리

데이터는 실험동물 5마리에 대한 평균치와 표준편차로 나타내었다. 유의성 검증은 SPSS ver. 14.0(SPSS Inc., Chicago, IL) software package program을 이용하여 Duncan's multiple range test를 행하였다. 

결과 및 고찰

1. 체중, 식이섭취량 및 식이효율

 지방 식이로 8주간 실험하였다(Table 2). 실험식이를 행하기 직전의 초기 체중은 모든 실험군에서 29.81∼32.86 g으로 각 실험군 간의 유의적인 차이를 보이지 않았다. 그러나 8주 후의 체중은 초기체중에 대하여 NC군은 23.13%가 증가하였으며, 각 개체 당 주별 체중증가량은 0.86 g을 나타내었다. 또, 고지방 식이를 행한 HC군은 46.00 g, UM군은 45.10 g, FM군은 44.40g으로 군별 간의 유의차는 보이지 않았으나, 초기 체중에 대한 증가율은 각각 46.60%, 37.75% 및 35.12%로 FM군에서 체중의 감소가 현저하였고(Table 2), 전 실험기간 동안 HC군에 비해 UM 및 FM군 모두 체중증가율이 낮게 유지되었다(Fig. 2). 즉, 주당 체중증가량은 NC군이 0.86 g인 반면 HC군은 1.83 g, UM군은 1.55 g, FM군은 1.44 g을 나타났다. 식이섭취량은 NC군과 UM군은 유사하였으나, HC군과 FM군은 NC군에 비해 각각 11.4% 및 18.57% 감소하였고, calorie 섭취량은 NC군에 비해 HC, UM 및 FM 군 모두 각각 32.44, 45.88 및 22.39% 증가하였다. 그리고 FER은 NC군에 비해 HC군은 2.5배, UM 및 FM군은 모두 2배 증가하였고, UM 및 FM군은 모두 HC군에 비해 20% 감소하였다.

Table 2. Effects of 2% UM and FM powder on body weight gain and feed efficiency ratio of mouse fed a high fat supplemented diets for 8 weeks

Fig. 2. Effects of 2% UM and FM powder on the changes in body weight (% against initial) of mouse fed a high fat supplemented diets for 8 weeks. Abbreviations: See Table 1 and 2. Values are means (n=5), and the values of the final week are mean±standard deviations (n=5). Different superscripts in the final week indicate significant differences (p<0.05).

이상의 결과, FM을 고지방 식이와 병행한 경우는 비록 UM의 경우와는 유의차가 없으나, HC군에 비하여 유의적인 체중 감소를 나타내는 현상이 섭취 칼로리와는 상반된 결과라는 점에서 기존에 보고된 바 있는 뽕잎의 체중 감소 효과가 peroxisomeproliferator activated receptor γ(PPARγ) agonist로 작용하여 식이섭취량을 감소시킴으로써 항비만 효과를 나타낸다(Park 등 2005)는 점과는 차이가 있는 것으로 사료된다. Rhyu 등(2003)은 Monascus속 미생물을 쌀에 번식시킨 홍국의 소화불량 개선효과를 보고하였으며, Jeon 등(2004)과 Chen 등(2008)은 홍국의 항비만 효과에 대하여 보고하였다. 이러한 결과를 미루어 볼 때 M. pilosus로 발효시킨 뽕잎차 분말이 나타내는 체중 감소 효과는 뽕잎의 성분과 미생물 발효에 의해 생성된 성분들의 복합효과로 사료된다. 

2. 장기 중량 및 부고환 주변 지방의 함량

8주간 사육한 정상식이군(NC)과 고지방 식이군(HC, UM 및 FM) mouse의 체중 100 g당 장기 중량을 조사한 결과는 Table 3과 같다. 간 중량은 NC군이 3.71%인데 비하여, 고지방식이 대조군(HC군)은 4.21%로 유의적으로 높았으나, 신장에서는 HC군이 오히려 낮은 값을 나타내었으며, 그 외 심장과 고환의 중량은 NC군과 고지방 식이군들 간의 유의적인 차이가 없었다. 고지방 식이에서는 당대사의 불균형과 과잉으로 생성되는 glucose flux 및 비정상적인 RNA와 DNA의 합성으로 간을 비롯한 장기들의 중량이 증가하는 것으로 알려져 있다(Wu 등 2007). 차 분말을 혼합한 고지방 식이 군들의 간 중량은 HC군에 비하여 유의하게 낮았으며, FM군은 NC군가 비슷한 값을 보였다. 한편, 부고환 주변 지방의 함량을 조사한 결과는 Fig. 3과 같다. 고지방 식이를 행한 HC군은 NC군에 비하여 부고환 주변 지방의 함량이 3.77배에 달했으나, UM군과 FM군에서는 HC군에 비하여 그 함량이 각각 10.61% 및 39.14%가 감소되었다. 이러한 결과는 체중증가량의 결과와 일치하는 것으로 뽕잎차 및 발효 뽕잎차의 항비만 효과에 의해 나타난 것으로 생각된다.

Table 3. Effects of 2% UM and FM powder on organs weight in mouse fed a high fat supplemented diets for 8 weeks

Fig. 3. Effects of 2% UM and FM powder on the content of fat around epididymal in mouse fed a high fat supplemented diets for 8 weeks. Abbreviations: See Table 1. Values are mean±standard deviations (n=5), different superscripts in the figures indicates significant differences (p<0.05).

3. 혈청 및 간 조직 지질 함량

간 조직 손상의 지표로 이용되는 혈청의 ALT 활성과 혈청 및 간 조직 중의 지질 함량 변동을 관찰한 결과는 Table 4 및 Fig. 4와 같다. UM군은 HC간의 유의차는 보이지 않으나, FM군은 HC군에 비하여 유의적으로 낮은 값을 나타내었다. HC군은 고지방 섭취로 인해 간장이 비대해지고, 동맥 내에 지질이 축적되는 등 관상 순환의 이상이 야기되면서 간 조직의 손상이 나타난 것으로 생각되나, FM군은 UM군에 비하여 고지방 식이로 유도된 간 조직 손상을 더욱 크게 완화시키는 것으로 보인다. ALT는 간장과 심장에 다량 분포하며, 아미노산의 생합성에 관여하는 효소로 약물이나 스트레스 등으로 간 조직이 손상을 받게 되면 그 활성이 증가하게 되므로 간손상의 지표로 활용되고 있다. 비만이 되면 간장에 지방이 축적되고 지방과산화물의 생성으로 활성산소종이 생성되면 간조직이 손상되면서 이들 효소의 활성이 증가한다. 또한 간염이나 고혈당 상태에서도 이들 효소의 활성이 증가하며, 간장의 상대적 중량도 증가한다(Reitman & Frankel 1957).

Table 4. Effects of 2% UM and FM powder on the content of lipid profiles in serum of mouse fed a high fat supplemented diets for 8 weeks

Fig. 4. Effects of 2% UM and FM powder on the content of hepatic TG (triglyceride) and TC (total cholesterol) of mouse fed a high fat supplemented diets for 8 weeks. Abbreviations: See Table 1. Values are mean±standard deviations (n=5), different superscripts in the figures indicates significant differences (p<0.05).

고지방 식이군에서는 HC군이 NC군에 비하여 triglyceride (TG), total cholesterol(TC), LDL-cholesterol의 함량 및 동맥경화지수(AI)는 각각 18.42%, 39.59%, 212.56% 및 230.70%가 증가하였으며, HDL-cholesterol 함량은 17.84%가 감소하였다. 그러나 UM군의 TG, TC, HDL- 및 LDL-cholesterol 함량은 HC군과 유의적인 차이가 없으나, FM군에서는 유의적인 차이를 보였으며, 동맥경화지수도 HC군 2.63, UM군 2.09, FM군 1.70으로 FM군에서 양호한 결과를 나타내었다.

TG와 혈중 cholesterol의 대부분은 lipoprotein의 형태로 LDL을 형성하며, 동맥경화증 발병과 비례관계에 있다(Gordon 등 1981). 한편, Yu 등(2003)은 Monascus속 미생물을 배양한 쌀(홍국)을 첨가한 식이에 의하여 HDL-cholesterol 함량이 증가되고, LDL-cholesterol 함량은 감소됨과 더불어 동맥경화지수가 감소된다고 하였다. 홍국의 임상실험에서도 TG, TC 및 LDL-cholesterol의 농도가 감소하며, 이는 HMG-CoA reductase의 활성을 저해하는 monacolin K의 효과로 설명되고 있다. 

8주간 사육한 마우스 간 조직의 TG와 TC 함량을 조사한 결과는 Fig. 4와 같다. 간 조직 TG 함량은 HC군은 22.08 ㎎/g tissue로 NC군의 2.04배가 되었으며, UM 및 FM군은 NC군에는 미치지 못하나 HC군에 비하여 25.18∼25.72%가 감소되었다. TC 함량에서도 HC군은 18.60 ㎎/g tissue인데 비하여 NC군의 10.59 ㎎/g tissue 로 약 1.8배 정도로 높았으나, UM군은 15.20 ㎎/g tissue로 HC군과 유의적인 차이를 보이지 않는데 비하여, FM군은 11.46 ㎎/g tissue로 HC군에 비하여 유의적인 감소를 나타내었으며, NC와는 거의 비슷한 수치를 나타냈다. 지방대사는 주로 간에서 일어나며, 간에서 합성된 TG를 정상적으로 제거되지 않으면 간에 지방이 축적되어 지방간을 유발한다(Schaefer EJ 1995). 본 실험의 결과는 뽕잎과 발효뽕잎은 고지방 식이 하에서 축적(Lee 등 2006)될 수 있는 간 조직내의 TG와 TC 함량을 감소시킴을 나타낸다. 이러한 결과는 Cha 등(2009)이 Monascus속 미생물로 발효시킨 홍국 첨가 식이에서와 유사한 결과이다.

본 실험의 고지방 식이군에서 간의 콜레스테롤 농도가 유의적으로 증가한 것은 고지방 식이가 혈중 중성지질을 상승시켜 간에서 VLDL의 생성을 증가시키고, 이로부터 전환된 LDL이 증가함으로써 이를 간에서 제거하는 과정에서 간 조직의 콜레스테롤 농도가 높아진 것으로 사료된다. 또 홍국균으로 발효시킨 뽕잎차 첨가군에서 고지방 식이 대조군에 비하여 콜레스테롤 함량이 현저히 감소한 것은 담즙산의 재흡수를 억제하여 내인성 콜레스테롤 함량의 저하를 유도(Kang 등 2003)함으로써 고콜레스테롤 혈증 개선 효과를 나타낸 것으로 사료된다. 

4. 간 조직 GSH, LPO 함량 및 혈청 ALT 활성

8주간 사육한 mouse의 간 조직 GSH 및 LPO의 함량과 혈청 ALT의 활성 변동을 조사한 결과는 Fig. 5, 6과 같다. GSH 함량은 고지방 식이 대조군인 HC군은 1.94 μmole로 NC군에 비하여 28.94%가 낮았으나, UM군은 2.54 μmole, FM군은 2.91 μmole로 FM군에서는 고지방 식이로 감소된 GSH 함량이 정상수준으로 회복되었다. LPO의 함량은 GSH의 함량과는 반대의 결과로 HC군이 NC군에 비하여 28.94% 감소하였으나, UM군과 FM군에서는 NC군 이하의 수준으로 낮아지는 경향을 나타내었으며, UM군에 비하여 FM군에서 더욱 낮았다. 

Fig. 5. Effects of 2% UM and FM powder on the content of hepatic GSH (glutathione) and hepatic LPO (lipid peroxide) in mouse fed a high fat supplemented diets for 8 weeks. Abbreviations: See Table 1. Values are mean±standard deviations (n=5), different superscripts in the figures indicates significant differences (p<0.05).

간 조직에서 GSH는 ROS(reactive oxygen spices)에 의한 LPO의 생성을 억제한다(Wang 등 2000). 체내의 각종 스트레스로 생성된 ROS는 다가불포화지방산으로부터 LPO를 생성하며, 생성된 LPO는 분해되어 aldehydes, ketones, lactones 등을 생성하여 세포조직의 손상과 노화를 촉진한다. 조직 중 GSH 함량이 감소하면 ROS에 의해 생성되는 LPO 함량이 증가하는 것으로 알려져 있으며, LPO의 함량은 생체막의 손상 정도를 알 수 있는 지표로 활용된다(Ohkawa 등 1979). 

한편, 간 조직 손상의 지표로 이용되는 혈청의 ALT 활성과 지방함량을 측정한 결과는 Fig. 6과 같다. 고지방 식이군에서는 HC군이 NC군에 비하여 1.58배나 높은 수치를 나타내었다. 그리고 UM군은 HC간의 유의차는 보이지 않으나, FM군은 HC군에 비하여 유의적으로 낮은 값을 나타내었다. HC군은 고지방 섭취로 인해 간장이 비대해지고, 동맥 내에 지질이 축적되는 등 관상 순환의 이상이 야기되면서 간 조직의 손상이 나타난 것으로 생각되나, FM군은 UM군에 비하여 고지방 식이로 유도된 간 조직 손상을 더욱 크게 완화시키는 것으로 보인다. ALT는 간장과 심장에 다량 분포하며, 아미노산의 생합성에 관여하는 효소로 약물이나 스트레스 등으로 간 조직이 손상을 받게 되면 그 활성이 증가하게 되므로 간손상의 지표로 활용되고 있다. 비만이 되면 간장에 지방이 축적되고 지방과산화물의 생성으로 활성산소종이 생성되면 간조직이 손상되면서 이들 효소의 활성이 증가한다. 또한 간염이나 고혈당 상태에서도 이들 효소의 활성이 증가하며, 간장의 상대적 중량도 증가한다(Reitman & Frankel 1957). 이상의 결과, M. pilosus로 발효시킨 뽕잎차는 정상 생리상태에서 보다는 고지방 식이에 의한 비정상 생리상태 하에서 체중을 감소시킴과 동시에 GSH의 함량을 높이고 LPO의 함량을 감소시 킴으로써 간 손상을 예방하는 효과가 있을 것으로 사료된다. 

Fig. 6. Effects of 2% UM and FM powder on the serum ALT (alanine aminotransferase) activities in mouse fed a high fat supplemented diets for 8 weeks. Abbreviations: See Table 1. Values are mean±standard deviations (n=5), different superscripts in the figures indicates significant differences (p<0.05).

5. 간 조직 XO, SOD, GST 및 GPX 활성

8주간 사육한 mouse의 간 조직 XO와 SOD 활성을 조사한 결과는 Fig. 7과 같다. XO 활성은 HC군이 NC군에 비해 2배정도의 높은 활성을 나타내었으나, UM군은 NC군 수준으로 감소되었으며, FM군은 UM군보다 유의적으로 낮은 활성을 나타내었다. 반면, SOD 활성은 HC군에서 10.25U로 낮았으나, UM과 FM군은 NC군과 유사한 활성을 나타내었다. GST활성 (Fig. 8)은 XO의 활성과 반대의 결과로 UM군과 FM군에서는 고지방 식이로 저해되었던 GST의 활성(HC군)이 NC군수준에는 미치지 못하나 회복되는 경향을 보였다. 또, GPX의 활성(NADPH nmole/min/mg-protein)은 고지방 식이 대조군인 HC군의 활성은 NC군의 65.59%에 불과하였으나 UM군과 FM군은 HC군에 비하여 각각 22.95% 및 38.52% 높았다(Fig. 8).

Fig. 7. Effects of 2% UM and FM powder on the hepatic XO (xanthine oxidase) and SOD (superoxide dismutase) activity in mouse fed a high fat supplemented diets for 8 weeks. Abbreviations: See Table 1. Values are mean±standard deviations (n=5), different superscripts in the figures indicates significant differences (p<0.05).

Fig. 8. Effects of 2% UM and FM powder on the hepatic GST (glutathione S-transferase) and GPX (glutathione peroxidase) activity in mouse fed for 8 weeks. Abbreviations: See Table 1. Values are mean±standard deviations (n=5), different superscripts in the figures indicates significant differences (p<0.05).

XO는 체내에서 xanthine oxidoreductase(XOR)로 존재하는 비특이적인 효소로 정상 생리상태에서는 NAD+를 전자수용체로 이용하는 dehydrogenase로 작용하나, 병리적 상태에서는 분자상의 산소를 전자수용체로 이용하는 XO로 작용하며, superoxide 및 hydrogen peroxide와 같은 ROS를 생성한다(Hashim 등 2005). SOD는 ROS 생성계에 의해 생성된 superoxide를 반응성이 낮은 hydrogen peroxide로의 전환에 관여하는 항산화효소로 알려져 있으며, GST는 selenium 비의존성 항산화 효소로 환원형 GSH를 이용하여 lipid hydroperoxide를 대응하는 lipid alcohol로 환원시킬 뿐만 아니라, 친전자성 물질과 환원형 GSH의 포합반응에 관여하는 해독효소로 고지방 식이에 의한 비만 상태 하에서는 그 활성이 크게 감소한다(Lee 등 2010). GST는 체내에서 phase Ⅰ 반응에 의해 생성된 electrophilic compounds를 무독화시키는 phase Ⅱ 반응에 관여함으로 acetaminophen 등과 같은 생체 내에서 조직 손상이나 발암 등을 유발하는 것으로 알려져 있는 electrophilic compounds를 생성하는 독성물질의 해독에 긍정적인 영향을 줄 것으로 생각된다(Ajith 등 2007). 또한 GPX는 GSH를 이용하여 hydrogen peroxide뿐만 아니라, ROS에 의해 생성된 LPO를 무독화 시키는 효소로 고지방 식이 하에서는 그 활성이 감소하는 것으로 알려져 있다(Lee 등 2011b). 따라서, 비만에 의해 유도되어 상승한 XO 및 감소한 SOD, GST와 GPX 활성이 홍국균으로 발효시킨 뽕잎차의 섭취로 NC군으로 회복되고, 결국, 간기능을 개선하는 효능이 있을 것으로 사료된다.

6. 간 조직의 광학 현미경 관찰

실험식이 8주 후의 마우스 간 조직을 검경한 결과는 Fig. 9와 같다. 고지방 식이 대조군인 HC군에서는 거의 모든 간조직 세포가 지방 방울의 축적에 의해 확장되어 간굴모세혈관(hepatic sinusoids)이 폐쇄된 상태이며, 염증성 세포들이 부분적으로 침윤되어 있는 간 조직 손상이 나타났다(arrow). 그리나 고지방 식이와 실험 식이를 병행한 UM군과 FM군에서는 중심정맥 주위의 세포들이 정상적으로 잘 보존되어 있으며, 간 소엽의 간 세포삭과 간 조직 세포 내에 지방방울의 축적이 보이긴 하나 구분이 가능하며, UM군에 비하여 FM군 쪽의 간 손상이 다소 경미한 것으로 나타났다. 

Fig. 9. Light microscopic photographs of liver tissue (bar: 25 ㎛) of mouse fed with experimental diets for 8 weeks (HE stain). C: central vein. The hepatocytes in HC group are distended by accumulation of multiple fat droplets and sinusoids are occluded (arrow).

이상의 결과, 뽕잎차와 M. pilosus로 발효시킨 뽕잎차는 정상 생리 상태에서는 ROS의 생성과 소거가 균형을 이루고 있어 생체의 항산화 활성에 유의한 영향을 나타나지 않으나, 고지방 식이에 의한 비정상 생리상태 하에서는 체중 감소 효과와 더불어 GSH의 함량과 항산화 효소들의 활성을 증가시켜 ROS에 의해 야기될 수 있는 조직의 산화적 손상을 감소시킴으로써 간 손상 예방 또는 경감 효과를 나타내는 것으로 사료된다. 

감사의 글

본 연구는 농림수산식품부 농림바이오기술산업화지원사업(810007-03-3-SB110)에 의해 이루어진 것임. 

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