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ISSN : 1225-4339(Print)
ISSN : 2287-4992(Online)
The Korean Journal of Food And Nutrition Vol.34 No.5 pp.545-552
DOI : https://doi.org/10.9799/ksfan.2021.34.5.545

Effect of Natural Product Complex Extract (HAE-06) on Bronchial Dilation

Dae Sung Kim, Hye Yoom Kim*†
General Manager, Dept. of Research, Hanpoong Pharm & Foods Co., Wanju 54843, Korea
*Research Professor, Hanbang Cardio-Renal Syndrome Research Center, Wonkwang University, Iksan 54538, Korea
Corresponding author: Hye Yoom Kim, Research Professor, Hanbang Cardio-Renal Syndrome Research Center, Wonkwang
University, Iksan 54538, Korea. Tel: +82-63-850-6447, Fax: +82-63-850-7260, E-mail: hyeyoomc@naver.com
10/09/2021 01/10/2021 14/10/2021

Abstract


HAE-06 extract is a mixture of four medicinal plants, namely Lonicerae Folium et Caulis (Lonicera japonica), Scutellariae Radix (Scutellaria baicalensis), Adenophorae Radix (Adenophora triphylla var. japonica), and Polygonati Oddorati Rhizoma (Polygonatum odoratum var. pluriflorum). The HAE-06 extract demonstrated a concentration-dependent relaxing effect and enhanced cAMP production in bronchial smooth muscle that had been stimulated to contract with acetylcholine. Using a blocker, it was confirmed that the effect was through the β2-adrenergic receptor/cAMP/PKA pathway. In addition, it is thought that the HAE-06 extract has a bronchial smooth muscle relaxation effect by reducing the inflow of Ca2+ through the K+ and Ca2+ channels present in the sarcoplasmic membrane. If research continues in the future, it is believed that it will be possible to use it as a material for pharmaceuticals and functional foods.



천연물 복합 추출물 (HAE-06)의 기관지 확장에 미치는 영향

김대성, 김혜윰*†
한풍제약 연구부 부장
*원광대학교 한방심신증후군연구센터 연구교수

초록


    서 론

    만성 폐쇄성 폐질환(COPD)은 매년 전 세계적으로 300만 명 이상을 사망에 이르게 한다(Rabe & Watz 2017). 만성폐 쇄성폐질환은 초기에는 증상을 못 느끼고 기침과 호흡곤란 이 흔한 증상이기에 단순히 증상이 가라앉으면 질병이 없어 졌거나 나았다고 인식하곤 하곤 한다(Brandsma 등 2020;Ritchie & Wedzicha 2020). 가래, 기침과 함께 기관지 확장 증, 기관지 천식, 폐렴, 심부전, 폐암 등 여러 질환에서도 발 병되기 때문에 호흡기에 관련하여 급성 및 만성 기관지염, 감기, 기타 호흡기 감염 등의 질환과 관련하여 치료제로써 다양한 진해거담제 및 기관지 확장제가 많이 사용되고 있다 (Brandsma 등 2020). 기관지 점막에 알레르기성 염증이 생 기는 질환인 기관지 천식을 치료하기 위해서 좁아진 기관지 를 넓게 만들어 급성 호흡기 질환에 효과적인 ‘기관지 확장 제(bronchodilator)’나 알레르기의 근본인 염증을 제거하고 만성 호흡기 질환에 효과적이라는 ‘기관지 염증 치료제’를 사용하여 치료를 한다(Williams & Rubin 2018). 기관지 확 장제는 대표적으로 교감신경 자극제(β2-adrenergic agonist) 로써 기관지 근육의 경련을 완화시켜 확장효과를 보인다 (Cazzola 등 2012). 기도가 좁아지게 되면 기관지를 확장하 기 위하여 부교감 신경의 효과를 차단시켜주는 항콜린성 약 물(anticholinergics)도 널리 사용되고 있다(Matera 등 2020). 임상적으로 기관지 확장제는 급성 천식 발작 시 사용하며 강력한 기관지 확장작용을 나타낸다(Williams & Rubin 2018). 기관지 항염증제는 기관지의 알레르기 염증 반응을 억제하여 천식 발작을 예방하는 작용을 나타낸다(Kim & Criner 2013). 대표적으로 스테로이드(steroid)가 가장 효과적 인 천식 치료 약물로 알려져 있으며, 아젤라스틴(Azelastine), 크로몰린제(cromolyn), 트롬복산조절제(thromboxanes) 등이 사용되고 있다(Dasgupta 등 2013). 그 중, 천식 발작시 완화 시키기 위해 기관지 확장효과가 있다고 알려진 테오필린 (theophyline)은 기관지 확장 효과 외에도 항 알레르기 염증 효과가 있다고 알려져 있다(Cazzola 등 2012).

    기도의 평활근은 부교감신경(muscarinic receptors) 및 교 감신경(adrenergic receptor)의 지배를 받고 있으며 기도의 과민반응은 신경들 간의 불균형에 의하여 유발된다고 볼 수 있다(Cazzola 등 2012). 사람과 포유동물에서는 기관지에 손 상을 입게 되면 부교감신경이 자극되어 아세틸콜린(acetylcholine, ACh)의 분비에 의하여 기관지 경련이 유발되며 그 외 매개물질의 분비와 더불어 직접적으로 평활근에 작용하 여 기관지 수축을 유발 한다(Kume 등 2018). 한편 기관지 과민성에 의하여 기관 상피세포의 기능장애나 손상이 일어 나 기도 감염이나 천식을 유발시킬 수 있다(Wasilewski 등 2014;Lourenço 등 2020). 기관 내로 자극물질들이 들어왔 을 경우 기관 상피세포가 손상되어 있으면 외피유도이완인 자(epithelium-derived relaxing factor, EDRF)의 생성 방해, 신경전달물질들의 효소 분해 작용의 감소 등에 의해 장벽이 손상되어 기도를 자극하여 기도의 과민반응을 초래할 수 있 다(Farah 등 2009;Vanhoutte PM 2013). 세포 내 칼슘(Ca2+) 이 증가하게되면 Ca2+이 calmodulin이라는 단백질과 결합하 여 Ca2+-calmodulin 복합체를 형성하게 된다. 이 복합체는 마이오신 경쇄(myosin light chain, MLC) kinase를 활성화시 켜 myosin의 light chain을 인산화와 이로 인해 actinmyosin의 상호작용이 항진되게 되어 평활근이 수축된다 (Coultrap & Bayer 2014). 기관지 평활근은 근수축과 관련 된 무스카린성 수용체(Muscarinic acetylcholine receptor, mAChR)를 보유하고 있어, 고리형아데노신일인산(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)의 감소 및 K+통로의 폐 쇄로 인한 세포 내 Ca2+ 이온의 이동 증가나 β-아드레날린 성 수용체(β2-adrenergic receptor) 활성 작용 등으로 인하여 평활근 수축을 유도하게 된다(Semenov & Brenner 2018). 기관지 확장제 중 β2 항진제는 β2 수용체에 선택적으로 작 용하여 세포내 cAMP를 상승시켜 기도 평활근을 이완시킴 으로써 기관지확장 효과를 나타 낸다(Ehlert FJ 2003).

    천연물 기능성 소재들은 오랜 기간의 경험을 근거로 생리 활성 효능이 검증되었고, 낮은 부작용이 있다는 장점이있다 (Stamatiou & Pierris 2013). 이를 바탕으로 천연물 기능성 소재로부터 생리활성 물질을 탐색하여 질병의 예방 및 효과 를 갖는 제품을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다 (Kim SH 2010;Akopov 등 2015). 천연물 복합 소재는 천연 물로 구성된 여러 물질의 복합적인 구성이므로 다양한 성분 이 복합적으로 광범위한 효능을 나타낼 수 있으며, 추출 방 법 또는 배합비에 따라 효능이 달라질 수 있다(Lee 등 2011;Yoon WH 2013;Shin 등 2021). 따라서 천연물 기능성 소재 로부터 새로운 효능을 확인하기 위한 연구의 일환으로 HAE-06 추출물이 백서의 기관지 평활근 확장 효과에 대한 작용 기전을 검토하고자 했다. 본 연구에서는 사용 된 HAE- 06 추출물은 인동(Honeysuckle), 황금(Skullcap), 잔대(Japanese lady bell) 및 둥글레(Solomon's seal)의 혼합물로써, 학명 및 약 명은 Lonicera japonica(인동등), Scutellariae Radix(황금), Adenophora triphylla(사삼), Polygonatum odoratum(옥죽)으로 불리고 있다. 우리의 연구는 HAE-06 추출물의 새로운 호흡기증상 완화제 및 기관지 확장에 도움을 줄 수 있는 기능성 소재로써 개발에 필요한 기초 자료를 제공하려고 한다.

    재료 및 방법

    1. 천연물 복합 소재(HAE-06)의 추출 및 제조

    본 실험에 사용한 HAE-06 천연물 복합 소재는 인동, 꿀 풀, 잔대, 및 둥굴레로 구성되어 있으며, 그 비율은 8.8:1:1이 다(Table 1). 인동, 황금, 잔대 및 둥굴레는 동경종합상사에 서 구입하였으며, 30% 주정에 식초가 3% 되도록 혼합한 용 매로 추출 하였다(Table 1). 인동은 줄기와 잎을, 황금과 잔 대는 뿌리를 사용했으며, 둥굴레는 뿌리와 줄기를 사용했다. 95℃에서 3시간 동안 시료 중량의 10배 양을 가한 추출을 두 번 반복 했으며, 완료된 HAE-06 추출물은 원심 분리하여 여과하였고, 추출물을 농축하여 동결건조 후 냉동실에 보관 했다. 인동, 꿀풀, 잔대, 및 둥굴레를 8.8:1:1:1의 비율로 혼 합한 HAE-06의 각각 추출 수율은 28.8, 26.75, 31.4, 31.6, 22.05 및 25.25%였다.

    2. HAE-06 추출물의high performance liquid chromatography (HPLC) 분석

    천연물 복합 소재인 HAE-06 중 꿀풀의 성분인 baicalin 및 baicalein의 함량을 HPLC를 이용하여 분석하였다. HPLC는 Waters 2695, WatersTM 996 photodiode array detector (PDA)를 사용하였고, 컬럼은 Shiseido Capcell Pak C18 column을 사용하였다. 꿀풀 분석용 이동상은(A)1% acetic acid, (B)acetonitrile과 MeOH(7:3) 혼합액의 1% acetic acid 가 첨가된 두 용매를 45분간 변화시켰다(Table 2). 인동 분 석용 이동상은(A)0.1% formic acid, (B)100% MeOH에 0.1% formic acid가 첨가된 두 용매를 45분간 변화시켰다(Table 3).

    3. 기관지 분리

    몸무게 약 250~300 g의 수컷 백서(Sprague-Dawley)의 탈 골시킨 이후 흉곽을 절제하여 기관지를 분리한다. 분리된 기관지를 혼합기체(5% CO2와 95% O2)로 포화된 차가운 Krebs 용액(118 mM NaCl, 25 mM NaHCO3, 10 mM glucose, 4.7 mM KCl, 1.5 mM CaCl2, 1.2 mM KH2PO4, 1.1 mM MgSO4, pH 7.4)에 넣고 평활근을 손상시키지 않도록 결합조직 및 주위에 붙은 지방을 제거한 후 약 길이 3~4 mm의 절편을 만들었다. 본 연구는 원광대학교 동물실험 윤 리위원회의 규정에 따라 심의를 받은 후 진행하였으며, 동 물관리 규정을 준수했다(승인번호: WKU20-28).

    4. 기관지의 장력 측정

    기관지 절편을 37.4℃의 Krebs 용액에 혼합기체로 포화시 킨 orgam chamber에 넣어 장력(isometric tension)을 힘-변 위 변환기(Grass FT 03, GRASS Instrument, MA, USA)가 장착된 생리 기록계(Grass Model 7E, Grass Instrument, MA, USA)를 이용하여 측정한다. 이때 순환기(circulator, Model CW-10GL, JEIO TECH, Korea)에 의해 일정한 온도를 유지 한다. 기관지의 장력을 천천히 증가시켜 최적의 장력(2 g)에 도달하도록 하였으며, 90분 동안 안정적인 상태로 유지하도 록 했다. 기관지 절편은 아세틸콜린(acetylcholine, 100 μM) 으로 수축을 유도했으며, HAE-06 추출물을 농도 누적적으 로 첨하하여 기관지의 긴장도 변화를 측정했다. 아세틸콜린 으로 유도한 수축력을 100%로 가정하고 HAE-06 추출물의 이완율(%)을 산출했다.

    5. 기관지 cAMP의 측정

    Krebs 용액에 혼합기체(5% CO2와 95% O2)를 공급해 주 면서 기관지 절편을 넣어 30분간 유지 시킨 후 3-isobutyl- 1-methylxanthine(IBMX, 100 μM)과 아세틸콜린(100 μM)을 넣어 HEA-06 추출물(1, 2.5, 5 mg/mL)을 처리하여 반응 시 켰다. 반응 정지를 위해 기관지 조직은 곧바로 액체 질소에 넣어 cAMP 농도 측정에 이용했다. 기관지 조직을 염산(0.1 M, hydrochloric acid) 존재 하에서 균질화시킨 후 15분간 원 심 분리(13,000 g)하여 얻은 상층액을 dirict cAMP ELISA kit(Enzo, ADI-900-066)를 이용하여 측정했다.

    6. 통계분석

    실험의 결과들은 평균±표준편차로 표기하였으며, student t-test를 이용하여 유의성을 검증했다(Sigma plot 10.0 프로 그램). 통계적인 유의성은 p값이 0.05 이하인 경우를 기준으 로 판정했다.

    결과 및 고찰

    1. 천연물 복합 소재(HAE-06)의 함량 분석

    HAE-06 추출물 중 황금의 대표적인 성분인 바이칼린 (baicalin) 및 바이칼레인(baicalein) 함량을 분석하였다(Bae 등 2005;Woo 등 2007). 바이칼린의 retention time은 8.041 분으로 나타났으며 함량은 36.8 mg/g으로 확인 되었다. 바 이칼레인은 retention time이 16.382분이었고 함량은 1.4 mg/g으로 확인 되었다(Fig. 1A). HAE-06 중 인동등의 로가 닌(loganin)(Jeong 등 2015)은 retention time이 18.574분이며 함량은 16.2 mg/g, 로가닉산(loganic acid)은 retention time 이 12.01분이며 함량은 5.8 mg/g, 스웨로사이드(sweroside) 는 retention time이 16.383분이며 함량은 4.3 mg/g으로 확인 되었다(Fig. 1B).

    2. HEA-06 추출물의 기관지 이완 효과

    기관지평활근은 수축-이완 양상이 매우 유사해 보이지만 분포하고 있는 수용체는 각각 다르다고 알려져 있다. 백서 의 기관지에는 muscarine 수용체가 존재하여 carbachol이나 acetylcholine과 같은 약물에 반응하는 반면, histamine 수용 체는 존재하지 않는다(Ishii & Kurachi 2006;Kume 등 2018). 따라서 본 실험에서는 무스카린 수용체를 통한 수축 에 대하여 HAE-06 추출물의 기관지 이완 효과를 확인했다. 기관지의 부교감신경이 자극되어 아세틸콜린(acetylcholine, ACh)의 분비를 초래하게 되면 평활근에 대한 무스카린 수용 체 M3(muscarinic acetylcholine receptor M3)에 직접적인 작 용으로 기관지 수축을 유발 시킨다(Ishii & Kurachi 2006). 따라서, 본 연구에 기관지에 아세틸콜린(acetylcholine)을 사 용하여 수축을 유도한 후 HEA-06의 이완 효과를 확인했다. HEA-06 추출물의 이완효과를 알아보기 위하여 아세틸콜린 (10 μM)으로 기관지 평활근 수축을 유도한 후 HEA-06 추 출물을 0.5, 0.75, 1, 2.5, 및 5 g/mL의 농도로 누적하여 처리 한 결과 이완효과가 나타났으며(Fig. 2A), 5 mg/mL 농도에 서 69.8±5.96 %의 이완효과를 보였다(Fig. 2B). 기관지 평활 근 이완 기전을 알아보고자 다음 실험을 진행했다.

    3. HEA-06 추출물의 β2-adrenergic receptor/cAMP/PKA 경로를 통한 기관지 이완 효과

    자율신경계 중 β2-아드레날린성 수용체(β2-adrenergic receptor)는 기관지를 이완시킨다고 알려져 있다(Barisione 등 2010). β2-아드레날린성 수용체를 활성화하면 흥분성 G 단백(stimulated G. protein, Gs)에 결합하여 아데닐릴 고리 화효소(adenylyl cyclase, AC)를 흥분시키고 세포 내 2차 전 령인 고리형아데노신일인산(cAMP)의 농도를 증가시킨다. 이어 cAMP의존적이 단백질 키나아제 A(protein kinase A, PKA)를 활성화시켜 마이오신 경쇄(myosin light chain, MLC) kinase의 억제와 MLC phosphatase의 활성을 유도하여 칼슘 이온(Ca2+) 레벨을 감소시킴으로써 최종적으로 기관지를 확 장시킨다고 알려져 있다(Barisione 등 2010). 따라서, HEA-06 추출물의 이완효과가 기관지 확장기 치료물질의 대표적인 경 로(Taouil 등 2003)인 ‘β2-adrenergic receptor/cAMP/PKA’ 경 로를 통해서 일어나는지 확인하기 위하여 실험을 진행했다.

    먼저, HEA-06 추출물의 기관지 확장효과가 β-아드레날 린성 수용체를 통해 일어나는지 확인하기 위하여 비선택적 β-아드레날린성 길항제인 propranolol(1 μM)(Al-Majed 등 2017)을 전처리 한 후 기관지 이완효과를 살펴본 결과 유의 한 차단효과를 보였다(Fig. 3A). 따라서 HEA-06 추출물이 β- 아드레날린성 수용체에 관여한다는 것을 확인 할 수 있었 다. 그 다음, 아데닐릴고리화효소(AC)에 관여하는지 확인하 기 위하여 활성제(forskolin) 및 길항제(SQ22536)를 처리하 여(Insel & Ostrom 2003) HEA-06 추출물의 기관지 이완에 미치는 영향을 살펴봤다. 아데닐릴고리화효소 활성 유도물 질인 forskolin(10 μM)을 전처리 한 후에 HEA-06 추출물의 이완효과를 알아본 결과, 96.16±8.96%로 유의한 증가 효과 를 확인할 수 있었다(Fig. 4A). 반면 SQ22536(100 μM, 아데 닐릴고리화효소 차단제)을 전처리 한 후 HEA-06 추출물의 이완효과를 알아본 결과 유의성 있는 차단 효과를 확인할 수 있었다(Fig. 4B). 기관지 평활근 조직에서 HEA-06 추출물이 cAMP-PKA에 영향을 미치는지 관찰하기 위하여 HEA-06 추출물을 농도별(0, 1, 2.5, 및 5 g/mL)로 처리하여 cAMP 생성량을 측정한 결과, HEA-06 추출물을 처리하지 않은 군 에 비하여 농도 의존적으로 cAMP생성량이 control군에 비 하여 유의성 있는 차이를 보였다(Fig. 5A). 또한, cAMP의존 적이 단백질 키나아제 A(PKA)의 억제제로 알려진 KT5720 (Townsend 등 2012)을 10 또는 100 μM 전처리 하여 HEA- 06 추출물의 이완효과를 알아본 결과, 100 μM 농도에서 이 완효과가 유의하게 차단됨을 확인 할 수 있었다(Fig. 5B). 따라서 HEA-06 추출물은 β2-아드레날린성 수용체를 통한 cAMP 증가와 PKA의 활성에 관여하여 이완효과를 보인다 고 사료된다.

    4. HEA-06 추출물의 포타슘(K+) 및 칼슘(Ca2+) 통로 차단 시 이완 효과

    세포 내 칼슘 이온이 증가하면 수축이 유도되는데 이때 세포 외 포타슘(K+) 농도가 증가 한다. 포타슘의 세포내 유 출은 세포막의 과분극을 일으켜 전압 의존성 칼슘 통로 (voltage-sensitive Ca2+ channel)의 불활성화로 이어져 평활 근 세포내 칼슘의 농도 감소를 초래하게 되어 이완을 유발 한다(Kitsiopoulou 등 2007). 평활근 세포내 칼슘(Ca2+) 농도 가 증가하면 칼모듈린(calmodulin)과 결합하여 미오신 경쇄 연쇄 키나아제(myosin light chain kinase, MLCK)는 미오신 조절 경쇄(myosin light chain, MLC)의 인산화를 촉진시켜 평활근을 수축 시키는 것으로 알려져 있다(Zhang 등 2010). 근소포체(sarcoplasmic Reticulum)에서의 저장된 Ca²⁺의 방 출은 리아노딘 수용체(RyR)라고 하는 Ca²⁺ 방출통로를 거 쳐 일어난다(Delmotte & Sieck 2015). 이러한 기전을 바탕 으로 포타슘 및 칼슘 통로에 영향을 받아 이온의 유입에 영 향을 주어 이완효과가 일어나는지 알아보기 위하여 실험을 진행했다. HEA-06 추출물의 기관지 이완 효과가 포타슘 통 로가 영향이 있는지 알아보기 위하여 비 선택적 포타슘 통로 억제제인 tetraethylammonium(TEA, 100 μM)와 4-aminopyridine( 4-AP, 100 μM)을 전처리하여 살펴본 결과, HEA- 06 추출물의 이완 효과가 유의하게 차단되는 것으로 확인하 였다(Fig. 6A). 또한, L형 Ca2+ 통로를 통해 HEA-06 추출물 의 이완효과가 일어나는지 확인하기 위하여 L형 칼슘 통로 차단제인 diltiazem(1 μM)과 verapamil(1 μM)을 전처리한 결과 HEA-06에 의한 이완효과가 유의하게 차단되는 것을 확인했다(Fig. 6B). 따라서 HEA-06 추출물의 이완 효과가 에 있어서 포타슘 채널의 영향으로 세포내 칼슘 방출을 유 도하여 이완에 영향을 미치는 것으로 사료된다.

    요약 및 결론

    본 연구를 통하여 천연물 기능성 소재인 HAE-06 혼합 추 출물의 기관지 평활근 이완 효과 및 그 기전을 확인했다. 사용 된 HAE-06 추출물은 인동(Lonicera japonica), 황금(Scutellariae Radix), 잔대(Adenophora triphylla), 둥글레(Polygonatum odoratum)의 8.8:1:1의 비율로 에탄올+식초용매로 추출한 혼합물이다. 아세틸콜린으로 수축을 유도한 기관지 평활근 은 HAE-06 추출물에 의해서 농도 의존적으로 이완 효과를 보였으며, 이 효과는 β2-adrenergic receptor/ cAMP/PKA 경 로를 통해서 나타남을 확인할 수 있었다. 또한, 근형질막에 존재하는 K+과 Ca2+ 통로를 통한 Ca2+의 유입을 감소시킴으 로써 HAE- 06 추출물의 기관지 평활근 이완효과가 있을 것 으로 사료된다, 따라서 기관지 확장에 있어서 HEA-06 추출 물이 유용한 정보를 제시해 준다고 할 수 있으며, 앞으로 연 구들이 지속된다면 기능성식품 소재로서의 이용이 가능할 것으로 생각된다.

    감사의 글

    본 논문은 (유)한풍제약을 통하여 HEA-06 시료 및 분석 자료를 제공받아 실험을 진행 했으며, 한국연구재단(NRF- 2019R1I1A3A01062432)의 연구비를 지원을 받았습니다.

    Figure

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    HPLC chromatograms showing peaks corresponding to the marker compounds, baicalin and baicaein (A); loganin, loganic acid, and sweoside (B) of HEA-06 extract.

    HPLC, high performance liquid chromatography.

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    Dose-response curves by HEA-6 treatment in acetylcholine-induced bronchi.

    (A) Representative response physiological activity diagram by HEA-06 dose-dependent treatment in intact rat bronchi. (B) HEA-06 extract treatment has bronchial dilatation effect in the state of bronchoconstriction by acetylcholine 100 μM (B) (n=8).

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    Dose-response curves by HEA-6 treatment in acetylcholine-induced bronchi.

    Bronchial relaxation effect of HEA-06 treated with (A) non-selective β-adrenergic receptor antagonist, Pro (10 μM). pro, propranolol. Data are expressed as mean±standard error of the mean (n=5). *p<0.05, ***p<0.001 vs. vehicle.

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    Dose-response curves by HEA-6 treatment in acetylcholine-induced bronchi.

    Bronchial relaxation effect of HEA-06 treated with (A) adenylyl cyclase inhibitor and (B) PKA inhibitor. Forsk, forskolin 10 μM, inhibitor of adenylyl cyclase; SQ, SQ22536 100 μM, selective inhibitor of protein kinase A. Data are expressed as mean±standard error of the mean (n=4). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. vehicle.

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    Effect of cAMP-PKA pathway activation by treatment on HAE-06 extract.

    (A) The amount of cAMP produced by HAE-06 concentration in the bronchi was compared and shown as a graph. (B) Dose-response curves on the bronchodilation induced by HEA-06 in the acetylcholine- contracted treca in the absence or presence of selective inhibitor of protein kinase A, KT (10 or 100 μM). cAMP, cyclic adenosine monophosphate; KT, KT5720. Data are expressed as mean±standard error of the mean (n=5). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. vehicle.

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    Dose-response curves for HEA-06-induced bronchodilation in acetylcholine contractile bronchi in the absence or presence of blockers.

    Treatment results of non-selective K+ channel blockers TEA(100 μM) and 4-AP(100 μM)(A) and L-type Ca2+ channel blockers Vera(1 μM) and Dilt(1 μM)(B). TEA, tetraethylammonium; 4-AP, 4-aminopyridine; Vera, verapamil; Dilt, diltiazem. Data are expressed as mean±standard error of the mean. *p<0.05, **p<0.01 vs. vehicle. Data are expressed as mean±standard error of the mean (n=4). *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. vehicle.

    Table

    Mixing ratio of HEA-06 extract
    HPLC gradient conditions for the measurement of baicalin and baicalein in Scutellariae Radix
    HPLC gradient conditions for the measurement of loganin, oganic acid, and sweroside in Lonicera japonica

    Reference

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