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ISSN : 1225-4339(Print)
ISSN : 2287-4992(Online)
The Korean Journal of Food And Nutrition Vol.34 No.3 pp.295-301
DOI : https://doi.org/10.9799/ksfan.2021.34.3.295

Nitric Oxide Production and Acetylcholinesterase Inhibitory of Activity Various Extracts from Codonopsis lanceolata by Steaming Times

Hyun-Suk Choi, DuBok Choi*†
Associate Professor, Dept. of Hotel Culinary Arts Patissier & Nutrition, Chungcheong University, Cheongju 28171, Korea
*Associate Professor, Dept. of Advanced Industry Convergence, Chosun University, Kwangju 61452, Korea
Corresponding author: DuBok Choi, Associate Professor, Dept. of Advanced Industry Convergence, Chosun University, Kwangju
61452, Korea. Tel: +82-62-230-7956, Fax: +82-62-608-5253, E-mail: choidb@chosun.ac.kr
24/05/2021 07/06/2021 11/06/2021

Abstract


Steaming is a method that has traditionally been used for medicinal plant extraction. This study investigated nitrite oxide production, ferrous ion chelating activity, α-glucosidase, xanthine oxidase, and acetylcholinesterase inhibitory activities of ethanol, acetone and hot-water extracts of Codonopsis lanceolata prepared by steaming seven times. MTT assay showed that each extract was non-toxic up to a concentration of 700 μg/mL confirming that there was no cytotoxicity in all extracts. The α-glucosidase, xanthine oxidase, and acetylcholinesterase inhibitory activities exhibited by the hot-water extract obtained from steaming seven times were higher (83.1%) than the other extracts. Higher production of nitrite oxide and better ferrous chelating activity was recorded with hot-water extract compared to ethanol and acetone extracts. These results indicated that more steaming of Codonopsis lanceolata extracts would be required to validate the possibility of developing antioxidants. Also, further study is needed to determine if the components present in the tested extracts might be useful in the prevention of Alzheimer's disease. These results showed that hot-water extracts may be useful for their antioxidant and the production inhibitory activity of nitrite oxide. It will be helpful in the investigation of the constituent analysis of the steam-processed product of Codonopsis lanceolata.



증숙 더덕 용매별 추출물의 Nitric Oxide 생성 저해 효과 및 Acetylcholinesterase 저해활성

최현숙, 최두복*†
충청대학교 식품영양외식학부 부교수
*조선대학교 신산업융합학부 부교수

초록


    서 론

    Hydrogen peroxide(H2O2), hydroxyl(OH), superoxide anion radical(O2)및 singlet oxygen(1O2) 등과 같은 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)은 질병의 원인이 되며(Citron M 2002;Portelius 등 2006), 이들의 생성억제를 위한 약용식물에 대한 관심은 꾸준히 연구되고 있다. 또한 신체내 nitric oxide(NO) 는 신호전달에 위해 필요한 매개체이지만, NO가 과다하게 생산될 때는 질병의 원인이 되기도 한다(Choi 등 2017), 그 중 peroxynitrite의 과다생산, 활성산소종의 생성과 지속적인 스트레스는 뇌의 해마 부위에 손상을 주어 기억장해 증상을 수반하는 알츠하이머 질환의 또 다른 원인이 될 수 있다 (Citron M 2002;Portelius 등 2006;Han 등 2010). 최근에는 다 양한 염증질환을 천연물로 기반하여 염증매개물질의 생성이 나 활성을 억제 할 수 있는 항염증 효과에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다(Sakanaka 등 2005). 식물의 증숙 과정은 세 포의 구성성분들의 변화 유도로 유용성분 용출을 극대화하 는 가공법으로(Song 등 2012) 제품의 기호성을 향상시키고 (Kang 등 2015) 항산화 성분이 증가한다는 연구보고가 있다 (Hong 등 2007). 더덕도 증숙 과정으로 인해 유도된 물질로 다양한 생리활성에 관한 연구가 보고되어 있다(Maeng & Park 1991;Han 등 1998;Lee JH 2002;Shim 등 2004;Byeon 등 2009;Ichikawa 등 2009). 따라서 본 연구는 이전 Lee 등(2021) 의 연구결과를 바탕으로 증숙의 횟수를 달리한 시료 중 폴리 페놀 함량이 가장 높았던 7회 증숙 과정을 거친 더덕의 에탄 올, 아세톤 및 열수 추출물을 사용하여 LPS자극에 의해 유도 되어지는 NO 생성 억제효과, xanthine oxidase, α-glucosidase 효과 및 철 이온(Fe2+)에 대한 chelating 효과를 측정하였다. 또한 알츠하이머 질병의 가장 확실한 치료 방법인 아세틸콜 린 분해 억제를 위해 아세틸콜린에스터라아제(AChE) 저해 활성을 검색하여 뇌신경세포를 보호할 수 있는 예방 물질로 의 효과를 검색해 보았다.

    재료 및 방법

    1. 더덕의 증숙 및 추출물의 제조

    본 실험의 더덕(Codonopsis lanceolata)은 전북지역에서 2019년 6월에 상품가치가 떨어지는 하위품질을 구매하여 1 kg으로 정량하여 90℃에서 2시간 동안 증숙한 후 36시간 60℃ 에서 건조하는 과정을 각각 7회의 과정으로 거쳤다. 7회 증 숙한 더덕을 100 g씩 나누어 500 mL의 에탄올, 500 mL의 아 세톤 및 500 mL의 뜨거운 물을 사용하여 각각 5 시간동안 실온에서 환류 추출 후 여액을 감압 농축하여 시료로 사용하 였다(Table 1).

    2. MTT assay

    7회 증숙 더덕의 용매별 추출물에 대한 세포독성을 알아 보기 위해 RAW264.7 세포를 96-well plate에 5×104 cells/well 의 농도로 분주하여 100 μL의 DMEM 배지와 함께 증숙 더덕 용매별 추출물을 500, 600, 700 μg/mL로 처리하여 24시간 배 양하였다(Mosmann T 1983). 5 μg/mL의 MTT 용액을 각 well 에 50 μL씩 가하여 4시간 동안 배양한 후 배지를 제거하였 다. 각 well에 100 μL의 DMSO용액을 첨가하여 생성된 formazan 결정을 용해시킨 뒤 발색 정도를 550 nm에서 흡광 도를 측정하며, 세포를 포함하지 않은 추출물의 흡광도를 기 준으로 약물처리군의 상대적인 세포생존율을 계산하였다.

    Cell viability(%)= [(시료구 흡광도-대조구 흡광도)/증류수 흡광도]×100

    3. Nitrite oxide 생성 억제 활성 측정

    Raw 264.7 세포를 96well plate에 1×104 cells/well이 되도록 분주하고 24시간(37℃, 5% CO2) 동안 배양한 후, 700 μg/mL 추출물시료과 lipopolysaccharide(LPS)를 혼합하여 최종 농도 2 μg/mL로 48시간(37℃, 5% CO2) 동안 배양하였다. 세포 배양 액을 각 well에서 50 μL씩 회수하여 새로운 96well plate에 옮 기고 50 μL의 Gries 시약(0.1% N-(1-naphtyl)etylenediamine:1% sulfanilamide=1:1)을 첨가하여 상온에서 10분간 반응시켜 540 nm에서 시료 무첨가구의 흡광도(PBS)를 사용하여 흡광 도를 측정하였다. NO 생성량의 정량은 표준물질 sodium nitrite를 농도별로 조제하여 동일한 방법으로 측정하였다 (Ding 등 1988).

    아질산염 소거능 (%)= 100-{(시료구 흡광도/시료 무첨가구 흡광도)×100}

    4. 철 이온(Fe2+)에 대한 chelating 효과 측정

    Yen 등(2002)의 방법에 따라 시료추출액 1 mL, 80% ethanol 0.8 mL, 2 mM FeCl2・4H2O[iron(II) chloride tetrahydrate] 용액 0.1 mL, 5 mM ferrozine[3-(2-pyridyl)-5,6-diphenyl-1,2,4- triazine-4',4''-disulfonic acid] 용액 0.1 mL를 첨가한 다음 혼합 하여 실온에서 10분간 반응 시킨 후 562 nm에서 흡광도를 측 정하였다. 대조구는 대표적 chelating agent인 ethylene diamine tetra acetic acid(EDTA)를 사용하였다.

    Ferrous ion chelating effect(%)= 100-[(시료구 흡광도/ 대조구 흡광도)×100]

    5. α-Glucosidase 저해활성 측정

    시료 50 μL, 1 uint/mL α-glucosidase 0.05 mL와 200 mM potassium phosphate buffer(pH 7.0) 50 μL를 잘 혼합하여 37℃ 에서 10분간 처리하였다. 다음에 3 mM ρNPG(ρ-nitrophenyl α- glucopyranoside) 100 μL를 첨가하여 37℃에서 10분간 반응시 킨 후 0.1 M Na2CO3 0.75 mL로 반응을 정지시켜 405 nm에서 흡광도를 측정하였다(Kim 등 2008).

    α-Glucosidase inhibitory activity(%)= [1-(시료구 흡광도/대조구 흡광도)]×100

    6. Xanthine oxidase 저해활성 측정

    추출물 0.1 mL와 0.1 M potassium phosphate buffer(pH 7.5) 0.6 mL에 2 mM xanthine 기질액 0.2 mL를 첨가하고 xanthine oxidase(0.2 uint/mL) 0.1 mL를 가하였다. 다음 37℃에서 15분 간 반응시킨 후 1N HCl 1 mL를 가하여 반응을 종결시킨 후, 반응액 중에 생성된 uric acid의 양을 292 nm에서 흡광도를 측정하였으며 계산식에 의하여 산출하였다(Stirpe 등 1969).

    Xanthine oxidase inhibitory activity(%)= 100-[(시료구 흡광도/ 대조구 흡광도)×100]

    7. Acetylcholinesterase 저해 활성 측정

    7회 증숙한 더덕의 용매별 추출물의 acetylcholinesterase (AchE)저해 활성은 Ellman법(1995)을 변형하여 측정하였다. AChE solution 50 μL, 0.1M sodium phosphate buffer(pH 8.0) 50 μL와 각 용매별 추출물(700 μg/mL) 25 μL를 37℃, 30분간 반 응시킨 후 3 mM 5,5'- dithio-bis-2-nitrobenzoic acid(DTNB) 용 액 100 μL와 0.075 M acetylcholine iodide 25 μL를 첨가하여 412 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소활성의 저해도는 아 래의 식을 이용하여 측정한다.

    Acetylcholinesterase inhibitory activity(%)= [1-(시료구 흡광도/대조구 흡광도)]×100

    8. 통계 처리

    본 실험에서는 각 실험 항목을 3회 반복 분석하였다. 통계 처리는 SPSS(version 12.0, Chicago, IL, USA)를 이용하여 다 른 부위간의 유의성 검정은 p<0.05 유의수준에서 t 검정하였 고, 가열 처리간의 유의성 검정은 일원배치분산분석(ANOVA) 과 던컨의 다중검정(Duncan’s multiple range test)을 실시하여 p<0.05 유의수준에서 다중비교하였다.

    결과 및 고찰

    1. 증숙더덕 용매별 추출물의 세포독성

    7회 증숙 한 더덕의 에탄올(EDS7), 아세톤(ADS7) 및 열수 추출물(HDS7)의 300, 500, 700 μg/mL 농도별 세포 독성을 MTT법으로 실험한 결과는 Fig. 1과 같다. 에탄올(EDS7)추출 물은 500 μg/mL농도에서 96.3%, 600 μg/mL 농도에서 96%, 700 μg/mL 농도에서 95.2%를 나타내었다. 아세톤(ADS7)추 출물은 500 μg/mL 농도에서 95.8%, 600 μg/mL농도에서 96.1%, 700 μg/mL 농도에서 95.6%를 나타내었으며, 열수 추출 물(HDS7)은 500 μg/mL 농도에서 96.8%, 600 μg/mL 농도에서 97%, 700 μg/mL 농도에서 97.3%를 나타내었다. 각각의 추출 물은 500, 600, 700 μg/mL 농도에서 대조군 평균 97.5%와 비 교시 세포독성을 나타내지 않았다. 각각의 농도에서 열수 추 출물(HDS7)이 에탄올추출물(EDS7) 및 아세톤 추출물(ADS7) 보다 세포 생존율이 높았다. 세포독성 실험결과 7회 증숙 용 매별 추출물이 향후 인체 및 식품에 적용시 안전성과 고농도 까지 사용이 가능하여 향후 각종 바이오 소재로 이용 시에도 사용 될 수 있을 것으로 생각된다.

    2. Nitrite oxide 생성 억제 활성 및 철 이온(Fe2+)에 대한 chelating 효과 측정

    7회 증숙 용매별 추출물을 세포독성 실험 결과 중 가장 높 은 농도(700 μg/mL)와 염증 유발물질인 LPS를 투여하여 용 매별 추출물이 RAW 264.7 세포내에 LPS에 의해 생성되는 NO의 저해 효과를 조사한 결과는 Fig. 2에 나타내었다. RAW264.7 세포에 LPS를 1.0 μg/mL 농도로 처리한 대조군에 서의 NO 농도는 55.2 μM로 크게 증가하였다. 700 μg/mL로 처리한 실험군의 NO 생성은 에탄올 추출물(ESD7) 35.2 μM, 아세톤 추출물(ADS7) 40.1 μM 및 열수 추출물(HDS7) 28.8 μM로 대조군과 비교 시 NO 생성의 저해효과가 나타났으며, 그 중 HDS7(열수 추출물)의 경우 NO의 생성은 대조군에 비 해 유의적인 저해 활성을 보였다. NO는 염증 매개인자로서 의 작용 및 일부는 diazoalkane으로 전환되어 암 등 질병을 유발하는 원인으로도 알려져 있으며 인체 내 NO의 농도를 유지하는 것은 매우 중요하다(Hsieh 등 2014). 식물의 추출물 에서의 NO 생성억제효과는 ROS의 생성을 억제시킬 수 있는 항산화력과 관련이 있으며, 폴리페놀류 및 플라보노이드류 등의 성분으로 인한 것이 보고되었다(Kim 등 2010;Link 등 2010;Song 등 2012;Kang & Kim 등 2015). Lee 등(2021)은 횟수를 달리한 증숙 더덕추출물의 총폴리페놀 함량 및 플라 보노이드 함량의 차이에 따른 항산화 및 항염증 효과가 있음 을 보고하였고, 본 실험에서도 7회 증숙 용매별 추출물 NO 생성 저해 효과가 관찰되었다.

    7회 증숙 더덕의 EDS7, ADS7 및 HDS7의 700 μg/mL 농도 에서 철 이온 제거능은 각각 79.3%, 58.9% 및 82.2%로 나타 났으며, 양성 대조군으로 사용한 BHT 96.6%와 비교시 HDS7(열수 추출물)에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 본 실 험 결과에서 7회 증숙 용매별 추출액은 용매의 종류와 농도 의 차이는 보였지만 모든 시료에서 금속이온 chelating 활성 을 가지고 있는 것으로 확인되었다. 생체 내의 Fe2+이온은 과 잉 시 지질과산화물 및 과산화수소의 생성을 촉진시켜 세포 의 직접적인 손상이나 노화 및 DNA 산화적 스트레스를 일으 키므로 chelating 활성이 높을수록 hydroxyl radical의 억제와 지방 산화의 반응작용을 감소시킬 수 있다(Stohs & Bagchi 1995;Su 등 2007). Lee 등(2021)은 횟수를 달리한 증숙더덕 추출물의 라디칼 소거능을 검토한 연구에서 폴리페놀 및 플 라보노이드류의 함량이 많은 분획물이 현저히 높은 것을 보 고하였으며, 추출 용매는 다르지만 철 이온(Fe2+)에 대한 chelating 효과도 같은 원인으로 생각된다.

    3. α-Glucosidase 및 xanthine oxidase 저해활성

    α-Glucosidase 저해활성으로 살펴본 항당뇨 효과에 대한 비교․분석 결과는 Fig. 3에 나타내었다. 당뇨병은 고혈당 상 태가 지속되는 질환으로 다양한 합병증으로 인한 사망률이 높은 대사 질환이다(Kim 등 2013). 소장 점막의 α-glucosidase 는 전분을 단당으로 분해하여 혈당을 높이며, acarbose과 같 은 α-glucosidase 저해제는 탄수화물의 흡수를 지연시켜 식후 혈당 상승을 완만하게 하지만 다양한 부작용이 존재한다고 알려져 있다(Puls 등 1984;Kim 등 2011). 본 연구결과의 7회 증숙 추출물의 α-glucosidase 저해효과는 700 μg/mL 에탄올 추출물(EDS7)에서는 57.7%로 저해활성이 가장 높았고, 아세 톤 추출물(ADS7)은 46.37%와 열수추출물(HDS7)은 56.1%의 활성을 나타났다. 이는 Lee 등(2021)의 연구 결과에서처럼 증 숙더덕의 용매별 추출물에서의 폴리페놀류가 혈당조절 완화 에 유용한 작용을 한 것으로 생각되며, polyphenol류의 α- glucosidase 저해효과 및 항당뇨 효과에 관한 많은 연구가 보 고가 있다(Farkas L 1980;Andrade-Cetto & Wiedenfeld 2001;Vertichevan & Jegadeesan 2002). 이는 부작용이 적은 식후 혈 당 강하의 효능이 있는 천연물 소재에 관한 연구에 도움이 될 것으로 생각된다.

    7회 증숙 더덕의 용매별 추출물과 양성대조구인 BHT와 비교하여 xanthine oxidase 저해활성을 Fig. 3에 나타내었다. 7회 증숙 더덕의 에탄올 추출물(EDS7)에서는 79.2%, 아세톤 추출물(ADS7)은 60.2% 및 열수 추출물(HDS7)은 80.1%로 나 타내었다. 산화적 스트레스에 의한 당뇨병의 발생 기전이 제 시되었고(Giugliano 등 1996) 또한 당뇨병으로 유발된 염증반 응은 활성산소의 생성과 제거의 불균형을 유발하고 조직을 손상시키며 합병증을 유발하는 등 인체에 위험 요인이 된다 (Jeong 등 2010;Youn & Kim 2012). 본 실험의 증숙 더덕의 용매별 추출물에서 나타난 xanthine oxidase의 저해 활성은 추 출물의 polyphenol류 때문인 것으로 생각된다. 항산화 효능을 증진시키는 phytochemical의 생리활성물질에 관한 항산화성 연구로 체내의 활성산소종을 제거하여 항산화 기전을 보호 한다는 연구가 있다(Hunt 등 1988;Lee 등 2012).

    4. 아세틸콜린에스테라아제 효소의 활성 측정

    AChE(acetylcholinesterase) 활성이 증가되어 acetylcholine (ACh)이 분해되어 콜린 기능이 결손되면 인지기능이 악화되 는 알츠하이머질환이 발생된다(Younkin 등 1986). ACh의 분 해를 막고 농도를 유지하는 AChE inhibitor가 치료제로 사용 되고 있다(Talesa VN 2001). 현재 AD 치료제로 rivastigmine, donepezil, tacrine 등이 사용되고 있으며(Figueiró 등 2010), 천 연물을 이용하여 AChE inhibitor를 탐색하여 알츠하이머 질 환을 치료하려는 연구가 수행되고 있다(Choi 등 2017). 이에 본 연구에서는 7회 증숙한 더덕의 700 μg/mL 농도의 용매별 추출물의 기억력 효능을 확인하기 위해 AChE 저해 활성을 측정하였으며 그 결과를 Fig. 4에 나타내었다. 에탄올 추출물 (EDS7)은 62.1%, 아세톤 추출물(ADS7)은 34.57%, 열수 추출 물(HDS7)은 70.2%의 저해 활성을 나타내었다. 양성대조군으 로 사용한 tacrine과 비교시 각 용매 추출물은 유의적인 결과 는 나타내지 못하였으나 열수 추출물(HDS7)에서 가장 높은 저해 활성을 나타내었다. 더덕의 증숙 과정에 따른 폴리페놀 성분이 scopolamine으로 유도된 기억력 손상에 대해 인지능 개선 활성에 효과 있다고 Weon 등(2014)에 의해 보고되었으 며, 이는 Lee 등(2021)의 연구결과와 같이 7회 증숙과정을 통 한 더덕의 총 페놀함량 및 플라보노이드류 증가로 생각되며 AChE 저해 활성은 항산화적 활성기전과도 관련이 있을 것으 로 생각된다.

    요약 및 결론

    본 연구에서는 이전의 연구결과를 바탕으로 증숙의 횟수 를 7회 반복한 더덕의 용매별 추출물을 선택하여 에탄올 추 출물(EDS7), 아세톤 추출물(ADS7) 및 열수 추출물(HDS7)을 사용하여 500, 600, 700 μg/mL의 농도범위에서 세포독성을 나타내지 않았다. NO 생성 억제활성은 각각의 용매별 추출 물이 700 μg/mL의 농도에서 가장 억제 활성이 좋았고 그중 아세톤 추출물(ADS7)에서 40.1 μM로 NO 생성의 저해효과가 가장 높게 나타났다. 철 이온에 대한 chelating 효과는 700 μg/ mL농도의 열수 추출물(HDS7)에서 82.2%의 활성을 나타내었 으며, α-glucosidase 저해 활성은 700 μg/mL 에탄올 추출물 (EDS7)에서 57.7%로 저해활성이 가장 높았다. Xanthine oxidase 저해활성은 열수 추출물(HDS7)이 80.1%로 가장 높은 활성을 나타내었다. AChE저해 효과는 각 추출물 처리군에서 유의적 인 결과는 나타내지 않았으나 열수 추출물(HDS7)에서 70.2% 로 저해 활성을 나타내었다. 본 연구를 통해 7회 증숙의 용매 별 추출물에 따른 기능성을 확인 하였으며 기능성 식품소재 로의 이용가치가 기대된다.

    감사의 글

    이 논문은 조선대학교 학술연구비의 지원을 받아 연구되 었음(2020).

    Figure

    KSFAN-34-3-295_F1.gif
    Effect of the ethanol (EDS7), acetone (ADS7), hotwater (HDS7) extracts of 7 Steamed Codonopsis lanceolata on the cell viability of RAW264.7 cells.

    The viability of cells was measured with MTT assay. Results were expressed as % of control absorbance. Results are mean±S.D. of triplicate data.

    KSFAN-34-3-295_F2.gif
    Reducing activity of LPS-induced NO production in RAW264.7 cells and Fe2+ chelating activity of the ethanol (EDS7), acetone (ADS7), hot-water (HDS7) extracts of 7 steamed Codonopsis lanceolata.

    Results are mean±S.D. of triplicate data. Different letters are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

    KSFAN-34-3-295_F3.gif
    α-Glucosidase and Xanthine oxidase inhibitory activities of the ethanol (EDS7), acetone (ADS7), hot-water (HDS7) extracts of 7 steamed Codonopsis lanceolata.

    Results are mean±S.D. of triplicate data. Different letters are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

    KSFAN-34-3-295_F4.gif
    Inhibitory effects against AChE of the ethanol (EDS7), acetone (ADS7), hot-water (HDS7) extracts of 7 Steamed Codonopsis lanceolata.

    Results are mean±S.D. of triplicate data. Different letters are significantly different at p<0.05 by Duncan’s multiple range test.

    Table

    Sample code name of the Codonopsis lanceolata extracts

    Reference

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