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ISSN : 1225-4339(Print)
ISSN : 2287-4992(Online)
The Korean Journal of Food And Nutrition Vol.34 No.2 pp.187-195
DOI : https://doi.org/10.9799/ksfan.2021.34.2.187

Antioxidant and Anti-Diabetic Activities of Soybean Fermented with Monascus

Sun Hee Kim*,**, Soon Ah Kang***,****
*Ph.D. Student, Dept. of Convergence Technology, Graduate School of Venture, Hoseo University, Seoul 06724, Korea
**Researcher, Institute of Health Industry, Hoseo University, Seoul 06724, Korea
***Professor, Dept. of Convergence Technology, Graduate School of Venture, Hoseo University, Seoul 06724, Korea
****Director, Institute of Health Industry, Hoseo University, Seoul 06724, Korea
Corresponding author: Soon Ah Kang, Professor, Dept. of Convergence Technology, Graduate School of Venture, Hoseo University,
Seoul 06724, Korea. Tel: +82-2-2059-2353, Fax: +82-2-2059-1405, E-mail: sakang@hoseo.edu
01/02/2021 19/03/2021 05/04/2021

Abstract


This study was performed to investigate the antioxidant and antidiabetic activities of soybean fermented with Monascus. Also, the changes in the content of isoflavones and Monacolin K were analyzed. It was observed that the glycoside forms of daidzin and genistin were converted to aglycones of daidzein and genistein within 6 days of fermentation. The product can be used as a health functional material that can increase bioavailability. Monacolin K production was found to increase significantly with the progression of fermentation with an increase to 0.04 mg/g and 0.44 mg/g on 6 and 12 days of fermentation, respectively. The DPPH radical scavenging activity of soybean fermented with Monascus was significantly increased compared to that of soybean. The protein expression of inflammation-related genes (TNF-α, IL-6, and COX-2) in the MIN cell was significantly increased in the presence of alloxan compared to the normal group, but a decrease was observed in the presence of soybean fermented with Monascus. In conclusion, soybean fermented with Monascus showed the highest antidiabetic and antioxidant effects. These results suggest that soybean fermented with Monascus has the potential to be used as a beneficial ingredient with antidiabetic and antioxidant effects.



홍국발효 대두의 항산화 및 항당뇨 활성

김 선 희*,**, 강 순 아***,****
*호서대학교 벤처대학원 융합공학과 박사과정 학생
**호서대학교 보건산업연구소 연구원
***호서대학교 벤처대학원 융합공학과 교수
****호서대학교 보건산업연구소 소장

초록


    서 론

    홍국균은 반자낭균과(Hemiascomycetaceae) 홍국균속(Monascaceae) 에 속하며 증백미에 Monascus속 곰팡이를 배양하여 적색 색 소를 내는 것이 특징이다(Lee 등 2007). 약 600년 전부터 동 아시아권 국가에서 보존제, 수산연제품, 축산가공품 등에 착 색제, 소화촉진제 등의 목적으로 사용되어 왔다(Pyo YH 2008;Jeong 등 2013;Kim 등 2015). 홍국균은 콜레스테롤 생 합성 효소인 HMG-CoA reductase의 억제 물질을 생산하여 혈 압 강하, 혈관 이완 효과 및 항산화 활성을 갖는 것으로 알려 져 있다(Pyo YH 2008). 홍국균의 생리활성물질인 monacolin K(lovastatin)는 식품의약품안전처 기준으로 500 mg/kg을 함 유하는 것을 기능성 원료로 인정하고 있는데, monacolin K의 생성량은 포도당 함량, 배양 과정 중 홍국균의 기질 접촉, 비 접촉 면적 등에 영향을 받는다(Park 등 2014). Hu 등(2020)의 연구에서는 홍국은 아세틸콜린을 방출시키는 신경 말단의 능력을 강화시켜 인슐린 분비를 증가시키고 췌장 세포의 M3R을 자극하여 인슐린 분비를 촉진시키는 역할을 한다고 보고하였다. 또한, 포도당 생성 억제, 포도당 섭취 촉진, β 세 포 보호, 인슐린 저항성 완화 등에 영향을 미쳐 항당뇨 효과 를 가지는 소재이다(Chang 등 2005).

    홍국균을 식품에 적용하면 기능성이 향상될 수 있는데, Pyo YH(2008)는 홍국균을 이용하여 콩을 발효시킨 홍국발효 콩 에서 mevinolin, 이소플라본 및 토코페롤 등 특정 생리활성 성분이 증가되어 새로운 고부가가치 제품으로서의 역할을 할 수 있을 것이라 보고하였다. 홍국을 접종한 특히 다양한 식품관련 선행연구를 통해 홍국의 우수한 기능성이 보고되 었는데, 식품의 기능성 효과를 조사한 선행 연구에는 홍국발 효 홍삼의 monacolin, mevinolin, lovastatin, acethylcholine과 같 은 생리활성 성분의 콜레스테롤 저하 작용, 혈압상승 억제 작 용(Park 등 2009), 홍국발효 백태와 서리태의 사포닌 및 GABA 생리활성 성분(Jin & Pyo 2015), 홍국발효 식초의 tyrosinase와 elastase 저해 작용에 의한 안티에이징 효과(Hwang 등 2016), 홍 국발효 참당귀 추출물의 항비만 효과(Kim 등 2018), 홍국균으 로 발효한 대두(Pyo YH 2006), 현미(Lee 등 2015) 등을 식품에 적용하여 홍국에 함유된 monacolin K와 이소플라본과 같은 생 리활성물질에 대한 연구와 같이 홍국을 활용한 식품들의 항산 화, 항염증, 항비만 효과에 대한 연구들이 활발히 진행되었다.

    대두는 발효식품인 된장, 간장의 주원료로서 단백질 함량 은 높고 지방함량이 낮은 식물 유래 식품으로 Kwon HJ(1999) 의 연구에 의하면 대두 추출물이 폐암 발생률을 감소시켰다고 보고하였다(Imm & Kim 2010). 특히, 대두에 함유된 daidzein, genistein과 같은 이소플라본은 혈중 콜레스테롤 저하 효과 외에도 항비만 및 항암효과가 있는 것으로 알려져 있다 (Sirotkin & Harrath 2014). 대두는 발효가 진행될수록 단백질, 지방, 탄수화물이 펩타이드, 아미노산, 지방산, 당으로 가수 분해되어 특유의 풍미가 생성되며 부패균이 생성하는 발암 물질의 생성이 저하되는 특징이 있다(Oh & Eom 2008). 대두 의 기능성을 조사한 선행 연구에는 면역조절 효과(Wei 등 1995), 항돌연변이성(Yoon 등 1996), 항암 및 항염증 효과 (Imm & Kim 2010), 항비만 효과(Park 등 2015;Kim 등 2020) 등이 있지만 홍국균 발효 대두의 항당뇨를 연구한 자료는 미 비한 편이다. 홍국균에 들어있는 monacolin K는 아세틸콜린 을 방출시키는 신경말단의 능력을 강화하여 인슐린 분비를 촉진시키며(Chang 등 2005), 흥국균의 발효를 통해 이소플라 본은 배당체에서 비배당체로 전환이 증가되므로 한국인이 가장 많이 섭취하는 대두를 흥국균으로 발효하면 식품의 기 능성이 향상될 수 있을 것이다. 따라서 본 연구에서는 항당 뇨 활성을 상승시키는 monacolin K가 함유된 홍국균을 접종 한 홍국발효 대두의 항산화 및 항당뇨 활성 평가를 통해 기 능성 신소재 개발에 활용하고자 하였다.

    재료 및 방법

    1. 홍국발효 대두 제조

    대두는 경상북도에서 생산한 백태(Glycine max)를 사용하여 건식 분쇄 공정인 에어제트 밀 및 그라인드 밀(Retsch ZM100, Retsch Inc., Rheinische, Germany)을 사용하여 초미세 분쇄하 여 분말화하였다. 분말화시킨 대두의 입도를 lazer particle size analyzer(Beckman Coulter Inc., Pasadena, CA, USA)로 분석한 결과, 평균 입도는 30.1 μm로 나타났으며 홍국발효 대두 제 조 전, 액상 기질화를 진행하였다. 초미세 분쇄 소재의 액상 발효에 적합한 홍국균주는 한국생명공학연구원에서 개발하 였고(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology 2015), 최적 조건에 맞는 Monascus sp. RY1 균주를 이용한 홍 국발효 대두를 제공받아 본 연구 시료로 사용하였다. 시료는 대두의 액상홍국발효를 위한 기본 배지로서 초미세분쇄 대 두 80 g/L, KH2PO4 2.5 g/L, MgSO4 1.0 g/L를 첨가한 배지로 구성 하였다. 무기질소원으로 기본배지에 sodium nitrate, ammonium nitrate, ammonium chloride, ammonium sulfate를 1.5 g/L 농도로 첨가한 후 배양 후 30℃에서 진탕 배양하였다.

    2. 홍국발효 대두 추출물 제조

    홍국발효 대두 추출물 제조를 위해 일반 대두와 대두 홍국 발효물을 -20℃에서 냉동시킨 뒤, 동결건조기(FD5512, Ilshin BioBase Co., Yangju, Korea)를 이용하여 건조하였다. 건조된 대두는 ultra-blender(Rumilly, Haute-Savoie, France)로 분말화 한 뒤 시료 1 g과 에탄올 10 g을 혼합하여 25℃에서 8시간 동안 3회씩 교반기(MS-53MH, JEIO TECH. Co., Daejeon, Korea)로 교반하여 추출하였다. 추출한 용액은 감압농축기 (EYELA Rotary Evaporator N-1110V-W, Rikakikai, Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 이용하여 농축 후 dimethyl sulfoxide(DMSO) 를 첨가하여 일정 농도로 제조한 뒤 본 실험의 시료로 사용 하였다.

    3. 이소플라본 분석

    대두와 홍국발효대두의 발효기간에 따라 이소플라본 분 석을 위해 Pyo & Lee(2006)Sun 등(2011)의 방법을 참고하 였다. 시료 0.5 g에 70% 에탄올 5 mL를 혼합한 뒤, 상온에서 30분 동안 ultra sonicator(Bransonic Z245151, Danbury, CT, USA)로 추출하였다. 추출한 용액은 12,000 g에서 15분간 원심 분리하여 상층액을 syringe filter(0.22 μm, Waters Co., Milford, MA, USA)로 여과하였다. HPLC analysis은 JASCO system (JASCO-HPLC-LC-4000, JASCO. Co., Tokyo, Japan)으로 YMCPack ODS-AM-303 column(250 mm×4.6 mm i.d., S-5 μm, 120Å, YMC Co., Kyoto, Japan)을 사용하였고 mobile phase는 0.1% phosphoric acid in acetonitrile(solvent A)과 0.1% phosphoric acid in water(solvent B)를 사용하였다. 시료 투입양은 20 μL 로 하였으며 solvent A를 50분 동안 15%에서 35%로 상승시 키면서 진행하고 35%에서 10분 동안 유지하였다. Column 온 도는 35℃, 용매 flow rate은 1 mL/min으로 260 nm에서 측정 하였다. 이소플라본 정량은 표준용액을 이용한 검량곡선을 이용하여 계산하였다. Waters HPLC system은 Model 2695 separation module system과 Model 2487 UV detector(Waters Corporation, Milford, MA. USA)를 사용하였다.

    4. Monacolin K 정량 분석

    홍국발효 기간에 따라 생성되는 monacolin K 분석을 위해 분말 시료 1 g을 10 mL의 추출용매 70% 에탄올에 2시간 용 해한 뒤 3,500 rpm에서 15분간 원심분리 하였다. 상등액을 syringe filter(PVDF nonsterile syringe filter 0.45 μm, 17 mm, National Scientific Supply Co., Claremont, CA, USA)로 여과하여 HPLC로 분석하였다(Oh 등 2018). 분석을 위한 column은 C18 column(5 μm pore size, 4.6×150 mm, Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA, USA)을 사용하였고 mobile phase는 acetonitrile과 0.1% phosphoric acid를 65:35(v/v) 비율로 혼합하여 pH 를 2.5로 조정한 뒤 이용하였다. Detector는 2487 UV(Waters Co., Milford, MA, USA)를 이용하여 237 nm에서 분석하였다. Monacolin K의 정량을 위해 표준물질인 mevinolin (Sigma- Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)으로 표준정량곡선을 제조하 여 이용하였다.

    5. 항산화 활성 평가

    DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거활성능을 측정하기 위해 0.1 mM DPPH 용액 3.75 mL와 추출물 0.25 mL를 10초간 혼합하여 암소에서 30분 동안 반응시켰다. 30분 반응 후에 UV-VIS spectrophotometer(Multidkan GO, Thermo Fisher Scientific Co., Waltham, MA, USA)로 517 nm에서 측정 하였다(Shamma & Bhat 2009). 대조군은 추출 시료와 동량의 메탄올 용액을 혼합하여 실험시료와 동일한 과정으로 실험 을 진행하였다. DPPH 라디칼 소거 활성능은 대조군이 50% 라디칼을 소거하는 시점의 시료의 양(EC50, effective concentration) 을 정하였다.

    6. 항당뇨 활성 평가

    MIN cell은 10% fetal bovine serum, penicillin(100 U/mL), streptomycin(100 U/mL) 및 nystatin(25 g/mL) 등을 함유한 RPMI 1640 배지에서 CO2 배양기(WS-180 CA, World Science Co., Bucheon, Korea)로 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였고, 3일마다 배양액을 교환하면서 배양하였다. MIN 세포에서 인 슐린 분비능력을 배양한 췌도에서 농도가 60 mg/mL인 저혈 당 농도의 배지(KRBB, 0.2% BSA)에서 1시간 동안 분비한 인 슐린 농도를 ELISA kit(LINCO Research, Inc., Billerica, MA, USA)를 사용하여 ELISA-reader(VERSA max, micro-reader, MDS Co., MO, USA)를 이용하여 측정하였다.

    췌장 β-세포에만 특이적으로 내독소성을 가지고 있는 alloxan의 처리를 통해 MIN 세포주의 혐기적인 상황에 대한 대두 홍국발효물의 방어능력을 NO 생성율로 측정하였다. 세 포의 생존율을 보기 위하여 MIN 세포주를 18시간 배양하고 96 well plate(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA)에 1×106/well 분포로 배양한 후, 70~80% 정도로 세포가 자라면 실험 시료인 대두 홍국발효물을 농도별로 25, 50, 100 μg/mL로 1시간 동안 전 처리한 후, alloxan 10 mM를 1~2시간 동안 병용 처리하였다. 홍국발효 대두의 농도별 처리에 의한 세포의 분화모습을 관찰하였다.

    Alloxan에 대한 항독소능 측정을 위하여 배지에 3-(4,5- dimethy thiozol)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(MTT, Sigma- Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 100 μg을 첨가하여 4시간 동 안 더 배양하였고, 배양이 된 후에는 배지를 버리고, dimethy lsulfoxide(DMSO, Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA) 100 μL를 가하여 MTT의 환원에 의해 생성된 formazan 침전물을 용해시킨 후 ELISA reader를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다(Carmichael 등 1987).

    Western blot을 이용한 염증 단백질 발현 측정을 위하여 분 리한 단백질은 Bradford assay 방법을 이용하여 단백질의 농 도를 정량하였다(Bradford MM 1976). 추출된 단백질을 SDSpolyacrylamide gel 전기영동으로 분리하고 polyvinylidene fluoride membrane(PVDF, Bio-Rad, National Scientific Supply Co., Claremont, CA, USA)으로 이동시킨 후, PBS-T를 함유한 5% 탈지유로 비특이적인 단백질을 blocking하였다. Blocking 과정 후에는 PVDF membrane을 PBS-T 3회, PBS 1회로 세척 한 다음 1차 항체를 4℃에서 overnight하면서 반응시켰다. 그 이후에 PBS-T 3회, PBS 1회로 세척한 다음 2차 항체를 실온에 서 2시간 동안 처리하였다. IL-6, TNF-α, COX-2 및 α-TUBLIN (Santa Cruz, Dallas, TX, USA) 1차 항체를 사용하였고, 각각에 맞는 2차 항체를 사용한 후 LAS-4000(Fujifilm Life Science, Tokyo, Japan)을 이용하여 확인하였다(Feghali & Wright 1997;Pan 등 2018).

    7. 통계 처리

    모든 실험의 데이터는 평균±표준편차(standard deviation, SD) 로 나타냈다. 통계분석을 위해 SPSS ver. 18 statistical software package(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)를 이용하여 One-way analysis of variance(ANOVA)를 실시한 후 Duncan’s multiple range test를 이용하여 각 실험군 간의 유의성을 검증하였고, 모든 검정의 유의수준은 p<0.05을 적용하였다.

    결과 및 고찰

    1. 홍국발효 대두의 이소플라본 함량

    대두의 홍국발효과정 중 이소플라본의 함량 변화 및 활성 형인 비배당체(aglycone)로의 전환에 대해 HPLC 분석 결과 는 Fig. 1과 같다. 대두의 대표적인 이소플라본이며 배당체형 인 daidzin과 genistin 형태는 Monascus sp. RY1 균주에 의한 발효과정 중 생체활성형인 비배당체 daidzein 및 genistein으 로 6일 이내에 거의 대부분 전환되는 것으로 나타났다. 대두 의 daidzein 및 genistein 함량은 48.50±9.33 ug/g 및 2.04±1.34 ug/g이었으나 홍국발효 대두는 각각 315.59±20.67 ug/g 및 289.35±16.55 ug/g으로 홍국에 의한 발효과정에서 비배당체 의 전환이 유의하게 증가하였다(p<0.05). 또한, 발효 6일 째에 각각 739.37±14.26 ug/g 및 1,125.56±27.34 ug/g으로 2~3배로 유의하게 증가하였다(p<0.05)(Table 1). 즉, 홍국발효대두의 배당체는 홍국균에 의하여 발효가 6일 진행될 때부터 비배 당체로 전환되는 양이 유의하게 증가하였다(p<0.05). 홍국발 효 대두는 발효 6일 째에 배당체는 239.56±15.68 ug/g이었으 나 비배당체는 1,864.27±21.59 ug/g으로 홍국에 의한 발효과 정에서 비배당체로의 전환이 유의하게 증가하면서 이루어짐 을 확인하였다(p<0.05). 본 연구에서 보여준 결과는 Hwang & Pyo(2018)의 연구에서도 홍국발효 콩에서 발효 기간에 따라 배당체 이소플라본은 대부분 비배당체형으로 생물 전환되는 것으로 보고되었다. 또한, Chen 등(2015)의 연구에서도 발효 홍국균 발효 시 pH가 감소함에 따라 가수분해가 일어나면서 비배당체 함량이 증가하였고 배당체 함량이 감소함을 보임 으로써 본 연구결과와 흡사한 경향성을 보였다. 대두에 함유된 이소플라본은 aglycone(daidzein, genistein, glycitein), β-glucoside conjugates(glucosides, malonyl glucosides, acetyl glucosides) 등 3가지 타입이 있고 4개의 다른 화학 구조를 가지는데 대부분 이 β-glucoside 형태로 존재하며 발효, 열처리와 같은 가공 과 정은 기존 이소플라본의 화학적 구조, 구성 요소 등에 영향 을 미친다(Ikeda 등 1995). 본 연구에서 홍국발효 시간이 경과 함에 따라 비배당체 함량이 증가한 결과는 홍국발효는 대두 의 이소플라본을 매우 효과적인 생리활성 형태인 유리형태 로 전환되는 것이 확인됨으로서 건강기능 소재로서 활용 가 능성을 높여 주었다.

    2. 홍국발효 대두의 monacolin K 함량

    콜레스테롤 저하 작용이 있는 것으로 알려진 홍국발효 대 사산물인 monacolin K 함량을 HPLC로 분석한 결과는 Table 2와 같다. Monacolin K는 생체 내 활성형인 acid 형과 비활성 형인 lactone 형으로 생산되므로 각각에 대해 분석한 결과, 초 미세 분쇄 대두를 발효한 경우 생산되는 monacolin K는 acid 형이 대부분인 것으로 나타났으며, lactone형의 생산은 매우 적었다. Acid 형과 lactone 형의 합계인 총 monacolin K 함량 은, 발효 6일에는 0.04±0.01 mg/g으로 서서히 생산되어 발효 12일에 총 monacolin K는 0.44±0.02 mg/g으로 유의하게 증가 하였고(p<0.05), 발효 20일에는 1.14±0.02 mg/g에 도달하면서 유의하게 증가하였다(p<0.05). Kang 등(2003)Lee 등(2015) 의 홍국발효 발아현미 연구에서도 홍국균 발효가 monacolin K 함량이 증가하여 본 연구와 유사한 경향을 보였다. 또한 Lee 등(2019)은 균이 성장한 뒤에 monacolin K가 생성되어 4 일간 발아가 진행될수록 홍국쌀의 monacolin K 함량이 5.3배 증가한다고 보고하였다. Lee 등(2015)의 연구에서는 monacolin K 함량이 현미(215.85 mg/kg), 백미(40.41 mg/kg)보다 32℃에 서 1일간 발아시킨 발아현미(1,263.04 mg/kg)에서 가장 높은 함량을 보였다. 이와 같은 결과로 보아 홍국발효 대두는 생 체 내 활성형인 monacolin K 함유율이 높아 건강기능소재로 활용가치가 높을 것으로 판단된다.

    3. 홍국발효 대두의 항산화 활성

    홍국발효 대두(UPSM)의 DPPH 라디칼 소거능 효과에 대 한 EC50 값을 구하여 ascorbic acid, trolox 및 홍국쌀과 비교 한 결과는 Fig. 2에 나타내었다. 본 실험에서 홍국발효 대두 의 DPPH 라디칼 소거능 효과는 26.55±2.10 mg/mL로 발효 전 대두의 소거능 효과(88.70±1.58 mg/mL)에 비하여 유의하게 라디칼을 소거할 수 있는 항산화 활성이 높았다(p<0.05). 항 산화 활성이 높은 양성대조군인 ascorbic acid(7.45±0.92 mg/ mL) 및 trolox(9.91±0.15 mg/mL)에 비하여 홍국발효 대두는 항산화활성은 유의하게 낮았다(p<0.05). UPSM의 라디칼 소 거능은 홍국쌀(33.62±1.33 mg/mL)보다 항산화 활성이 유의 하게 높게 나타남으로서(p<0.05) 홍국 접종이 대두의 항산화 활성을 높인 것으로 나타났다. Park 등(2009)의 연구에 의하 면 홍삼 추출물보다 홍국발효홍삼의 항산화능이 더 높아 본 연구 결과와 유사한 경향을 보였다. 또한, Park 등(2005)의 연 구에서는 홍국색소 성분을 용매분획법으로 분리한 결과, 홍 국이 BHT보다 높은 항산화 활성을 가지는 색소를 함유하였 다고 보고하였다. Lee 등(2015)의 연구에 의하면 홍국발효 발 아현미, 백미, 대두의 항산화능이 발아가 진행됨에 따라 유 의적으로 항산화능이 증가하여 본 연구 결과와 일치하는 것 으로 나타났다. 본 연구에서 홍국발효 대두의 항산화활성이 증가한 것은 Lee 등(2007)에 의하면 발아 시, 결합형 페놀 화 합물이 유리형으로 전환되어 페놀 화합물의 추출 수율이 증 가한다고 보고하였다.

    4. 홍국발효 대두(UPSM)의 항당뇨 활성

    췌장 β-세포에만 특이적으로 내독소성을 가지고 있는 alloxan의 처리에 의한 MIN 세포주의 혐기적인 상황에서 홍 국발효 대두(UPSM)의 방어능력을 측정한 결과는 Fig. 3과 같 다. 홍국발효 대두(UPSM)을 농도별로 전 처리하였을 때 UPSM25는 49.9±4.8%, UPSM50은 77.1±5.6%, UPSM100은 79.5±5.9%로 50~100 ug/mL 농도에서 유의적으로 NO 생성률 이 증가하여 가장 높은 NO 저해능을 보였다(p<0.05). Lee 등 (2010)의 보고에 의하면 높은 항산화능을 가진 식품 소재일 수록 높은 NO 저해능을 보인다고 하였는데, 이는 본 연구에 서 홍국발효 대두(UPSM)이 높은 항산화 활성과 NO 저해능 을 보인 결과와도 유사하였다. 홍국발효 대두(UPSM)의 농도 별 처리에 의한 MIN 세포주의 분화모습을 관찰한 결과는 Fig. 4에 나타내었다. 그 결과 홍국발효 대두(UPSM)의 농도 가 증가할수록 세포의 생존율이 증가하였는데, 이는 alloxan 에 의하여 파괴되는 정도가 감소하였기 때문인 것으로 사료 된다.

    MIN 세포주에 대하여 실험 시료인 홍국발효 대두를 농도 별로 25, 50, 100 ug/mL로 전 처리한 후 alloxan 10 mM를 병용 처리한 후 염증관련 사이토카인 유전자 발현을 측정한 결과 는 Fig. 5에 나타내었다. Alloxan 처리에 의하여 증가되었던 TNF-α와 IL-6의 발현은 홍국발효 대두(UPSM)를 농도에 의 존하여 유의적으로 감소하는 것을 볼 수 있었고, 특히 50 ug/mL와 100 ug/mL 처리군에서 크게 감소하였다(p<0.05). 또 한, alloxan 처리에 의하여 증가한 COX-2 발현은 홍국발효 대 두를 25 ug/mL와 50 ug/mL 처리에 의하여 통계적으로 유의 하게 감소하는 것을 볼 수 있었다(p<0.05). Suh 등(2003)의 연 구에서는 대두의 이소플라본이 TNF-α와 IL-6의 발현을 억제 한다는 보고를 하였고 본 연구에서는 홍국발효 과정에 의하 여 염증성 사이토카인을 감소시키는 결과를 보였다. Hu 등 (2020)에 의하면 당뇨병을 가진 쥐에게 홍국균의 주입이 공 복 혈당 수준을 감소시키고, glucose tolerance 개선, 인슐린 수치 증가, 포도당, 지질 관련 장애 완화 역할을 한다고 보고 하였다. 특히 Chang 등(2005)의 연구에서는 인슐린이 부족한 쥐에서 홍국균은 포도당 생성의 주요 효소인 PEPCK의 전사 를 억제하여 포도당 생성을 억제하였고 3T3-L1 지방세포 내 GLUT4의 인슐린 수용체, 단백질 키나제 B 인산화를 통해 포 도당 섭취를 촉진하여 최종적으로 항당뇨 효과를 확인하였 다고 보고하였다. Lee 등(2020)의 곡류 및 두류의 항산화, 항 당뇨 효과를 조사한 연구에 의하면 항산화 활성이 항당뇨 효 과와 유의적 상관관계를 보이면서 두류가 간세포의 포도당 흡수를 증가시켜 당뇨병에 도움을 준다고 보고하였다. 이상 과 같은 결과에서 홍국균을 이용한 발효과정은 항염증효과 를 증가시키는 결과를 보임으로써 기능성 소재의 가공방법 에 활용가치를 높일 것으로 보인다. 그러나 국내 및 국외에 서 홍국발효 대두의 항당뇨 활성을 검증한 자료는 미비하고 홍국발효를 통해 항당뇨 활성효과를 얻은 연구는 없어 본 연 구 결과가 홍국균 활용에 의한 당뇨병 예방 기능성 소재개발 에 도움이 될 것이라 생각된다.

    요약 및 결론

    본 연구는 홍국발효 대두의 항산화 및 항당뇨 활성효과를 검증하기 위해 이소플라본 및 monacolin K 함량 변화, 항산화 및 항당뇨 활성효과를 조사하였다. 홍국발효 대두의 이소플 라본을 분석한 결과 배당체형인 daidzin과 genistin 형태는 Monascus sp. RY1 균주에 의한 발효과정 중 생체활성형인 비 배당체 daidzein 및 genistein으로 전환되었다. Monacolin K 생 성은 홍국발효가 진행됨에 따라 함량이 유의적으로 증가하 는 것으로 나타났다. 항산화 활성을 측정한 결과 대두보다 홍국발효대두의 DPPH 라디칼 소거능은 유의하게 증가하여 홍국발효에 의해 항산화 효과가 증가하는 것으로 나타났다. 항당뇨 효과는 췌장 β-세포에만 특이적으로 내독소성을 가 지고 있는 alloxan의 처리에 의하여 증가되었던 TNF-α, IL-6 및 COX-2의 발현은 홍국발효 대두(UPSM)에 의하여 농도 의 존적으로 유의하게 감소하였다. 즉, MIN 세포주의 혐기적인 상황에 대하여 홍국발효 대두(UPSM) 처리에 의한 방어능력 이 입증되었다. 본 연구 결과에서 홍국발효 대두의 발효과정 중 비배당체의 전환 및 Monacolin K 함량의 증가를 볼 수 있 었고, 항산화 및 항당뇨 효과를 검증하였다. 이상과 같은 결 과는 질환예방용 기능성식품개발에 홍국균 활용에 의한 기 능성 소재개발에 도움이 될 것으로 사료된다.

    감사의 글

    본 과제 결과 일부는 한국생명공학연구원 지역산업기술 개발사업(70007070)의 지원을 받아 수행된 연구결과입니다.

    Figure

    KSFAN-34-2-187_F1.gif
    The HPLC chromatogram of the bioconversion of soy isoflavones during fermentation of ultrafine pulverized soybean by Monascus sp. RY1.

    (a) UPS: ultrafine pulverized soybean, (b) 6 d: ultrafine pulverized soybean fermented with Monascus for 6 days, (c) 12 d: ultrafine pulverized soybean fermented with Monascus for 12 days.

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    DPPH radical scavenging activity of UPS and UPSM.

    UPS: ultrafine pulverlized soybean, UPSM: ultrafine pulverlized soybean fermented with Monascus. Each value represents the mean±S.D. (n=3). a-dMeans with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range tests.

    KSFAN-34-2-187_F3.gif
    Relative NO concentration of ultrafine pulverlized soybean fermented (UPSM) with Monascus on MIN cell.

    Con: control, Alloxan: alloxan control, UPSM 25, 50, 100: alloxan control pretreated with UPSM 25, 50, 100 ug/mL. Each value represents the mean±S.D. (n=3). a-cMeans with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range tests.

    KSFAN-34-2-187_F4.gif
    Effect of ultra finely pulverlized soybean fermented with Monascus on MIN cell.

    A: control, B: alloxan control, C: alloxan control pretreated with UPSM-25 μg/mL, D: alloxan control pretreated with UPSM-50 μg/mL, E: alloxan control pretreated with UPSM-100 μg/mL.

    KSFAN-34-2-187_F5.gif
    Effect of Monacus fermented soybean on protein expression levels of TNF-α, IL-6 and COX-2 against alloxan induced pancreatic β-cell damage.

    Con: control, Alloxan: alloxan control, Alloxan+UPSM 25, 50, 100: alloxan control pretreated with UPSM 25, 50, 100 ug/mL. Each value represents the mean±S.D. (n=3). a-dMeans with the different letters are significantly different (p<0.05) by Duncan’s multiple range tests.

    Table

    Bioconversion of soy isoflavones during fermentation of ultrafine pulverized soybean by Monascus sp. RY1
    Production of Monacolin K during fermentation of ultrafine pulverized soybean by Monascus sp. RY1

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