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ISSN : 1225-4339(Print)
ISSN : 2287-4992(Online)
The Korean Journal of Food And Nutrition Vol.34 No.2 pp.233-241
DOI : https://doi.org/10.9799/ksfan.2021.34.2.233

Determination of the Contents of Apigenin and Luteolin in Vegetables

Kyung-Ja Kang†, Beom-Ho Kim*, Dae-hwan Kim, Hee-Jeong Yun, Young-Sun Cho, Na-Eun Han, Jong-Chul Choi**, Sung-nam Lee***, Ok-Kyung Choi****
Researcher, Ansan Agricultural and Fishery Products Inspection Center, Agricultural and Fishery Products Inspection Division, Gyeonggi Province Institute of Health and Environment, Ansan 15507, Korea
*Senior Researcher, Ansan Agricultural and Fishery Products Inspection Center, Agricultural and Fishery Products Inspection Division,
Gyeonggi Province Institute of Health and Environment, Ansan 15507, Korea
**Public Officer, Gyeonggi Provincial Government, Suwon 16444, Korea
***Assistant Researcher, Ansan Agricultural and Fishery Products Inspection Center, Agricultural and Fishery Products Inspection Division,
Gyeonggi Province Institute of Health and Environment, Ansan 15507, Korea
****Senior Researcher, Agricultural and Fishery Products Inspection Division, Gyeonggi Province Institute of Health and Environment, Suwon 16381, Korea
Corresponding author: Kyung-Ja Kang, Researcher, Ansan Agricultural and Fishery Products Inspection Center, Agricultural and Fishery Products Inspection Division, Gyeonggi Province Institute of Health and Environment, Ansan 15507, Korea. Tel: +82-31-290-6675, Fax: +82-31-438-5871, E-mail: green11@gg.go.kr
26/03/2021 13/04/2021 20/04/2021

Abstract


The purpose of this study was to investigate the contents of apigenin and luteolin in vegetables mainly distributed and consumed in Korea. In this study, the contents of apigenin, apigenin-7-O-glucoside, luteolin, and luteolin-7-O-glucoside in vegetables were surveyed by using liquid chromatography coupled to mass spectrometry (LC-MS/MS). According to the analysis of 27 items (91 samples) in vegetables, the content of total apigenin (the sum of apigenin and apigenin-7-O-glucoside) was quantified in 8 out of the 27 items in vegetables, followed by pepper leaves, parsley, celery, chamnamul, foremost mugwort, and perilla leaves. The content of total luteolin (the sum of luteolin and luteolin-7-O-glucoside) was found in 11 of the 27 items in vegetables, followed by pepper leaves, dandelion, celery, red lettuce, foremost mugwort, and perilla leaves. Celery was divided into stalks and leaves for comparing the contents of apigenin and luteolin. Celery showed higher contents of apigenin and luteolin in leaves than in stalks.



유통 채소류의 아피제닌 및 루테올린 함량 조사

강 경자†, 김 범호*, 김 대환, 윤 희정, 조 영선, 한 나은, 최 종철**, 이 성남***, 최 옥경****
경기도보건환경연구원 농수산물검사부 안산농수산물검사소 보건연구사
*경기도보건환경연구원 농수산물검사부 안산농수산물검사소 보건연구관
**경기도청 공무원
***경기도보건환경연구원 농수산물검사부 안산농수산물검사소 공무직연구원
****경기도보건환경연구원 농수산물검사부 보건연구관

초록


    서 론

    최근 식생활의 서구화로 동물성 식품의 섭취가 증가하며 당뇨, 고혈압, 심장병 등 만성 질환이 급속히 늘고 있다. 이에 따라 건강한 식생활에 대한 관심 증대로 채소의 중요성이 강 조되고, 채소류의 식물성유용성분(phytochemicals)에 대한 연 구도 활발히 진행되고 있다(Lee YE 2005;Kang 등 2006).

    식물성 유용성분 중 하나인 flavonoids는 식물유래 생리활 성 성분이자 대표적인 항산화 물질인 폴리페놀의 한 종류 (Umma 등 2012)로 식물의 2차 대사산물이다. Flavonoids는 anthocyanidins, flavones, flavonols, flavanones, flavanols, isoflavones, proanthocyanidins과 같은 물질들을 총칭하며, 벤젠 핵 2개를 propane으로 연결한 C6-C3-C6의 기본구조를 가지 고 있다(Andrés-Lacueva 등 2009). 이 중 flavones에 속하는 apigenin과 luteolin은 C2와 C3 사이에 이중결합과 C4 위치에 산소 원자를 가지고 있다. Flavonoids는 높은 항산화능과 함 께, 항바이러스, 항암 효과가 있고(Nonaka 등 1990, Ryu BH 1999;Mercader & Pomilio 2013), 알츠하이머 등의 뇌질환에도 긍정적인 효과가 있는 것(Onozuka 등 2008;Nones 등 2010;Mori 등 2012)으로 보고되고 있다. Apigenin은 항산화, 항돌연 변이, 항암 및 항염증 효과, 항균·항바이러스 활성(Rhim JY 2003;Wang 등 2019), 치매 예방 효능(Rezai-Zadeh 등 2008)이 있는 것으로 알려져 있다. Luteolin 또한 항산화, 항암 및 항 염증 효과, 항히스타민 활성(Rhim JY 2003), 치매 예방 효능 (Rezai-Zadeh 등 2008)이 있는 것으로 알려져 있다. 서양의 경 우 파슬리와 셀러리가 apigenin 및 luteolin의 중요한 원천으로 확인되었고(Lee YE 2005;Meyer 등 2006;Patel 등 2007), 이들 을 대상으로 한 연구가 많이 진행되어 있다(Meyer 등 2006;Plazonić 등 2009). 그러나, 국내에서 주로 유통되어 섭취되고 있는 채소류에 대한 apigenin 및 luteolin 함량 연구는 많지 않다.

    식품산업체의 영양관련 정보 수요조사(Korea Health Industry Development Institute 2001)에 따르면, 국내 하루 평균 섭취량 은 셀러리, 파슬리보다 상추, 쑥, 고춧잎 및 취나물 등이 더 많은 것으로 보고되고 있다. 따라서, 주로 소비되는 채소류 의 apigenin과 luteolin 함량 조사가 필요한 실정이다.

    본 연구에서는 채소류의 apigenin과 luteolin 함량을 LC-MS/ MS를 이용하여 조사하여 관련분야 종사자와 소비자에게 이 들 함량에 대한 기초자료로 제공하고자 하였다.

    재료 및 방법

    1. 시료

    시료는 경기도에서 유통되고 있는 채소류[식품공전(Ministry of Food and Drug Safety 2020) 분류기준: 엽채류, 엽경채류, 결구엽채류] 27품목(총 91건)(Table 1)이며, 경기도내에 있는 농수산물 도매시장과 대형 유통 매장에서 구입하여 사용하 였다. 구입한 시료는 분석 전까지 냉장 보관하였다.

    2. 시약 및 기기

    분석대상 표준물질은 apigenin(≥99%), luteolin(≥97%), apigenin-7-O-glucoside(≥97%), luteolin-7-O-glucoside(≥98%) 로 Supelco(USA)의 제품을 사용하였다. 표준품은 methanol에 용해하여 100~1,000 μg/mL의 표준원액으로 조제 후 혼합하 여 10 μg/mL의 혼합 표준용액을 만들어 -20℃ 이하에서 냉 동 보관하였다. 실험시 이를 희석하여 사용하였다.

    전처리 및 LC-MS/MS 분석을 위해 methanol(Burdick & Jackson, USA)과 formic acid(Wako, Japan)를 사용하였고, 초 순수제조기(Nanopure Diamond UV, Barnstead International, Massachusetts, USA)로 정제(비저항 18.2 MΩ)한 증류수를 사 용하였다. 전처리시 진탕기(MMV-1000W, Eyela, Japan)와 초 음파추출기(B8510E-DTH, Branson, USA)를 이용하여 추출하 였다. 원심분리기는 1236MGR(Gyrozen Co., Korea), 농축은 질소농축기(TurboVap LV, Caliper Life Science, USA)를 사용 하였다. Syringe filter는 PTFE(Polytetrafluoroethylene) 재질의 13 mm, 0.2 μm규격을 사용하였다.

    3. 시료 전처리

    시료 전처리시 추출은 페놀성 성분의 동시분석(Lee SG 2013) 및 폴리페놀과 플라보노이드 물질 추출방법에 관한 선 행연구(Woo 등 2010;Choi 등 2019;Ryu 등 2020)를 참고하여 진행하였다. 믹서기로 분쇄한 시료 2 g에 90% methanol(pH 3.0)을 가하여 50 mL로 정용하였다. 이를 300 rpm으로 10분 동안 진탕 추출한 다음 10℃ 이하에서 10분 동안 초음파 추 출하는 과정을 3회 반복 하였다. 그 후 고속원심분리기로 10 분 원심분리(4,000 rpm, 4℃)한 후 상층액을 5 mL 취한 다음 질소농축기로 40℃에서 감압농축하였다. 농축된 잔류물은 5% methanol을 5 mL넣어 재용해하고 0.2 μm PTFE(polytetrafluorethylene) syringe filter로 여과 후 LC-MS/MS로 분석하였다.

    4. 기기분석

    기기분석을 위한 LC-MS/MS는 Thermo사의 Q exactive focus를 사용하였다.

    LC 분석 조건은 선행연구를 참고하여 확립하였으며 (Panchal & Shah 2017), 컬럼은 Capcell Core C18 컬럼(2.1 mm×150 mm×2.7 μm, Osaka Soda Co., Ltd., Tokyo, Japen)을 사용하였다. 이동상 용매는 methanol(0.1% formic acid 첨가) 과 증류수(0.1% formic acid 첨가)를 사용하여 0.3 mL/min 유 속으로 10분 동안 2 μL씩 주입하였다(Table 2).

    LC-MS/MS의 이온화는 HESI(High Electrospray Ionization) 방법을 선택하였으며, Parallel Reaction Monitoring(PRM) mode 로 정성 및 정량분석을 하였다. Tune하여 apigenin, Luteolin, apigenin-7-O-glucoside 및 luteolin-7-O-glucoside의 m/z 값, 각 물질의 이온 값을 찾았다. 이온화 효율이 negative mode에서 높은 것을 확인 후 Mass traces 프로그램으로 CE(collision energy) 값, 정성 이온 및 정량 이온을 확립하였다.

    5. 유효성 검증 및 자료 분석

    본 연구의 유효성 검증은 ‘의약품 등 시험방법 밸리데이션 가이드라인(식품의약품안전처)’을 바탕으로 특이성, 직선성, 검출한계, 정량한계, 정확성 및 정밀성을 검증(Ministry of Food and Drug Safety 2015)하였다.

    본 연구에서 얻어진 실험결과는 3회 반복하고 평균±표준 편차(mean±S.D.)로 나타내었으며, 유의성 검증은 Microsoft Excel 2010(Microsoft, USA)을 이용하였다.

    품종별 비교 결과는 one way analysis of variance(ANOVA) 를, 부위별 비교 결과는 t-test를 실시하였고, 신뢰구간(p< 0.05)의 값으로 통계적인 유의성을 확인하였다. LC-MS/MS의 분석 조건은 Table 3과 같다.

    결과 및 고찰

    1. 시료 전처리

    본 연구에서는 선행연구를 참고하여(Kim 등 2001;Park 등 2004;Kim 등 2006) 추출방법으로 초음파 추출을 선택하였 다. 초음파 추출 시 추출시간이 증가할수록 총 폴리페놀 함 량도 증가하지만 추출시간이 30분보다 길어지게 되면 총 플 라보노이드의 함량이 감소된다는 연구(Woo 등 2010)결과를 참고하여 시료의 초음파 추출 시간을 30분으로 하였다.

    2. LC-MS/MS 분석

    Apigenin, apigenin-7-O-glucoside, luteolin 및 luteolin-7-O-glucoside의 LC-MS/MS 분석 결과 크로마토그램은 Fig. 1과 같다.

    3. 유효성 확인

    분석방법에 대한 신뢰성 확보를 위해 유효성 검증을 하였 고, 특이성, 직선성, 검출 한계와 정량 한계, 정확성 및 정밀 성을 확인하였다.

    1) 특이성(Specificity)

    특이성은 standard 물질과 blank 시료 각각의 chromatogram 을 함께 비교한 결과, 불순물 등의 분석 방해 물질이 없는 것을 확인하였다.

    2) 직선성(Linearity)

    직선성은 5개 농도의 혼합 표준용액을 5회 반복 분석 후, 직선성의 지표로 R2(Table 4)을 확인하였다. 분석대상물질 4 개의 R2 값은 모두 1로 나타나, AOAC 기준 R2값 0.99 이상을 만족하였다(AOAC 2013).

    3) 검출 한계 및 정량 한계

    검출 한계(Limit of detection: LOD)는 식 (1)의 공식과 같이 산출하였다. 분석 결과, 검출 한계는 0.002~0.003 μg/mL으로 나타났다(Table 4). 정량 한계(Limit of quantification: LOQ)는 식 (2)의 공식과 같이 산출하였으며, 혼합표준용액을 조제 후 5개의 농도로 희석하여 5회 반복하여 분석하였다. 분석 결 과, 정량 한계는 0.006~0.011 μg/mL으로 나타났다(Table 4).

    Limit of detection=3.3×σ/S
    (1)

    Limit of quantitation=10×σ/S
    (2)

    • σ: The standard deviation of the response

    • S: The slope of the calibration curve

    4) 정확성(accuracy) 및 정밀성(precision)

    정확성은 회수율을 이용하여 평가하였다. 셀러리 추출물 의 혼합표준용액 검출 농도와 추출물이 혼합되지 않은 표준 용액의 검출 농도 차이를 구하고 이 값을 셀러리 추출물만 분석하여 검출된 농도 값으로 나누어 3회 반복 측정하였다 (Table 5). 본 연구의 분석 방법은 회수율이 80.4~88.2%로 AOAC의 회수율 기준인 75~120%(1 μg/mL)(AOAC 2013) 이 내임을 확인하였다. 정밀성은 intra-assay precision으로 분석 하였다(Table 5). 본 연구에서는 혼합표준용액을 첨가한 셀러 리 시료를 대상으로 3회 반복하였고, 그 결과 본 연구의 분석 방법은 0.7~3.1%로 AOAC 기준인 상대표준편차 8%(1 μg/mL) 이내(AOAC 2013)임을 확인하였다.

    4. 채소류의 apigenin, apigenin-7-O-glucoside, luteolin and luteolin-7-O-glucoside 함량

    1) 품목별 결과

    채소류 총 27품목을 실험한 결과, 총apigenin(apigenin, apigenin- 7-O-glucoside 합)은 8품목(0.01±0.01~1.72±0.38 mg/100 g FW), 총 luteolin(luteolin, luteolin-7-O-glucoside 합)은 11품목(0.01± 0.01~2.93±0.81 mg/100 g FW)에 함유된 것으로 나타났다 (Table 6).

    채소류 중 총 apigenin 함량은 고춧잎(1.72±0.38 mg/100 g FW), 파슬리(0.67±0.03 mg/100 g FW), 셀러리(0.44±0.27 mg/100 g FW), 참나물(0.16±0.04 mg/100 g FW), 쑥(0.08±0.03), 깻잎 (0.07±0.02 mg/100 g FW) 순서로 높게 나타났다

    고춧잎의 총 apigenin 함량은 셀러리의 3.9배, 파슬리의 2.5 배 정도로 높은 함유량을 보유하고 있는 것을 확인하였다.

    채소류 중 총 luteolin 함량은 고춧잎(2.93±0.81 mg/100 g FW), 민들레(0.59±0.40 mg/100 g FW), 셀러리(0.55±0.33 mg/100 g FW), 적상추(0.31±0.10 mg/100 g FW), 쑥(0.28±0.16 mg/100 g FW), 깻잎(0.27±0.11 mg/100 g FW) 순서로 함량이 높게 나타 났다. 고춧잎의 총 luteolin 함량은 민들레의 4.9배, 셀러리의 5.3배 정도로 높은 함유량을 보유하고 있음을 확인하였다.

    대표적인 국내 다소비 채소인 상추는 적상추, 꽃상추, 청 상추 및 로메인상추 등 총 4품종으로 나누어 실험하였다. 총 apigenin 함량은 4품종이 0.02±0.01~0.03±0.03 mg/100 g FW로 종류별 차이가 없음을 알 수 있었다. 총 luteolin 함량은 적상 추(0.31±0.10 mg/100 g FW), 꽃상추(0.26±0.13 mg/100 g FW), 로메인 상추(0.22±0.20 mg/100 g FW), 청상추(0.16±0.05 mg/100 g FW) 순서였다. 적상추에서 가장 많은 함량이 검출되었으 나, 품종에 따른 유의적인 차이는 없었다(p<0.05). 고춧잎의 총 플라보노이드 함량은 생체 중 100 g당 480 mg인 것으로 보고(Ku 등 2009) 되었고, DPPH 라디컬 소거능을 가지는 플 라보노이드 화합물인 apigenin과 apigenin 배당체를 분리한 연구결과(Park 등 2007)도 있다. 또한, 고춧잎의 항산화 활성 은 플라보노이드 함량에 의존적이라는 결과(Ku 등 2009)가 있다. 이번 실험에서 사용한 채소류 중 고춧잎의 총 apigenin 및 총 luteolin 함량이 가장 높았다.

    셀러리 및 파슬리에서도 총 apigenin 및 총 luteolin 함량이 높게 나타났다. 셀러리, 파슬리 등의 식물에는 apigenin에 의 한 항암효과 보고(Rhim JY 2003;Patel 등 2007)와 셀러리에 apigenin과 luteolin이 함유되어 있다는 결과(Hertog 등 1992) 가 있다.

    민들레는 luteolin-7-O-glucoside 함량이 luteolin 함량보다 더 높은 것으로 보고(Lee SL 2010)되고 있으며, 본 연구결과 도 같은 경향을 나타냈다.

    깻잎에서 apigenin과 luteolin이 검출된 연구(Jo JO 1995)와 쑥에서 apigenin이 보고된 결과(Lee 등 2018)가 있다.

    청상추와 적상추의 flavonoids 함량을 비교했을 때, 적상추 에서 함량이 더 높았으며, luteolin 함량도 적상추에서 더 높 았다는 보고(Cao 등 2010)가 있다.

    반면 본 연구에서는 엽채류 중 방풍나물, 머위잎, 비름나 물, 시금치, 씀바귀, 청경채, 취나물, 치커리, 호박잎, 부추, 미 나리, 참두릅, 달래와 결구엽채류, 셀러리를 제외한 엽경채류 에서는 apigenin과 luteolin이 검출되지 않았다.

    플라보노이드 함량은 자외선, 이산화탄소 수치와 관련 있 는 것으로 알려져(Daniel 등 1999;Caldwell 등 2005)있다. 또 한, 그 함량은 시료의 생장 정도, 품종 및 분석방법에 따라서 도 다를 수 있다(Jo JO 1995)고 한다. 그러므로 유사한 식품이 라도 계절과 지역의 차이(Um & Kim 2007)가 있고, 분석방법 이 상이하면 플라보노이드 수치는 다르게 측정 될 수 있다.

    한국인의 flavonoids 섭취량과 식품군별 섭취량의 상관관 계를 분석해 보았을 때 채소군 및 과일군과 상관관계가 높 고, flavones은 주로 배추김치, 수박, 풋고추, 고춧가루를 통해 섭취하는 것으로 보고(Yang YK 2011)된 바 있다.

    채소류의 apigenin 및 luteolin 함량을 확인한 결과, 월별 제 철 농산물(MAFRA 2017)에 이들 성분이 고르게 분포되어 있 음을 확인하였다. 봄철 제철 농산물인 쑥(4월), 민들레(봄부 터 여름사이), 쑥갓(5월)과 여름철 제철 농산물인 깻잎(7월), 셀러리(7월), 참나물(8월)과 가을철 제철 농산물인 고춧잎 (10~11월)을 각 계절에 섭취함으로써, 사시사철 apigenin 및 luteolin등의 우수한 생리활성효과를 얻을 수 있음을 확인할 수 있다.

    2) 셀러리 부위별 결과

    Apigenin 및 luteolin이 함유된 품목 중 셀러리를 줄기 및 잎으로 나누어 각 함량을 비교한 결과, apigenin, apigenin-7- O-glucoside, luteolin 및 luteolin-7-O-glucoside 함량이 모두 줄 기보다 잎에서 높게 나타났다(Table 7).

    총 apigenin(apigenin, apigenin-7-O-glucoside 합), 총 luteolin (luteolin, luteolin-7-O-glucoside의 합) 함량은 셀러리의 잎과 줄기에 따라 유의적인 차이를 나타내었다(p<0.05)(Fig. 2 및 Fig. 3). 이는 셀러리 잎에 apigenin 및 luteolin이 많이 함유되 어 있다는 보고(Cao 등 2010)와 일치한다. 또한 셀러리에서 apigenin 및 luteolin이 줄기보다 잎에 더 많이 함유되어 있다 는 연구결과(Hostetler 등 2017)와 같았다.

    요약 및 결론

    본 연구는 국내에서 주로 유통되고 소비되는 채소류의 apigenin 및 luteolin 함량을 조사하기 위한 것이다. 이를 위해 LC-MS/MS를 이용해 채소류 총 27품목(총 91 건)의 apigenin, apigenin-7-O-glucoside, luteolin 및 luteolin-7-O-glucoside 함량 을 분석하여 다음과 같은 결론을 얻었다. 채소류 27품목 중 총 apigenin(apigenin, apigenin-7-O-glucoside 합)은 8품목에 함 유된 것으로 나타났다. 총 apigenin 함량은 고춧잎, 파슬리, 셀 러리, 참나물, 쑥, 깻잎 순서로 높게 나타났다. 채소류 27품목 중 총 luteolin(luteolin, luteolin-7-O-glucoside 합)은 11품목에 함유된 것으로 나타났다. 총 luteolin 함량은 고춧잎, 민들레, 셀러리, 적상추, 쑥, 깻잎 순서로 높게 나타났다. 대표적인 국 내 다소비 채소인 상추의 apigenin 및 luteolin 함량을 품종별 로 분석한 결과, 적상추, 꽃상추, 청상추 및 로메인 상추 4품 종의 총 apigenin 함량은 차이가 거의 없었다. 총 luteolin 함량 은 적상추, 꽃상추, 로메인 상추, 청상추 순서로 높게 나타났 으나, 유의적인 차이는 없었다(p<0.05). 셀러리는 줄기 및 잎 으로 나누어 총 apigenin 및 총 luteolin 함량을 비교해 보았다. 그 결과, 셀러리 줄기보다 잎에서 모두 총 apigenin 및 총 luteolin 함량이 높게 나타났다. 본 연구결과는 채소류의 apigenin과 luteolin 함량에 대한 영양학적 기초자료로 활용하 려 한다.

    Figure

    KSFAN-34-2-233_F1.gif
    LC-MS/MS chromatogram of apigenin, apigenin-7-O-glucoside, luteolin, and luteolin-7-O-glucoside
    KSFAN-34-2-233_F2.gif
    Total apigenin content by part of celery.

    Each bar represented mean±S.D. of triplicate determinations(p<0.05).

    KSFAN-34-2-233_F3.gif
    Total luteolin content by part of celery.

    Each bar represented mean±S.D. of triplicate determinations(p<0.05).

    Table

    27 items of vegetables for monitoring
    LC analytical conditions for the analysis of apigenin, apigenin-7-O-glucoside, luteolin and luteolin-7-Oglucoside
    LC-MS/MS analytical conditions for the analysis of apigenin, apigenin-7-O-glucoside, luteolin, and luteolin-7- O-glucoside
    Linearity, LOD(limit of detection), and LOQ(limit of quantitation) results of analytical method for apigenin, apigenin-7-O-glucoside, luteolin, and luteolin-7-O-glucoside
    Recovery and intra-assay precision results of apigenin, apigenin-7-O-glucoside, luteolin, and luteolin-7-O-glucoside
    The content of apigenin, apigenin-7-O-glucoside, luteolin, and luteolin-7-O-glucoside of vegetables
    The content of apigenin, apigenin-7-O-glucoside, luteolin and luteolin-7-O-glucoside of vegetables

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