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ISSN : 1225-4339(Print)
ISSN : 2287-4992(Online)
The Korean Journal of Food And Nutrition Vol.33 No.5 pp.483-492
DOI : https://doi.org/10.9799/ksfan.2020.33.5.483

Antioxidative and Anti-Inflammatory Activities of Salvia plebeia R. Br Extracts

Yeong-Ye Lee*,**, Soon Ah Kang***.****
*Ph.D. Student, Dept. of Convergence Science and Technology, Graduate School of Venture, Hoseo University, Seoul 06724, Korea
**Researcher, Institute of Health Industry, Hoseo University, Seoul 06724, Korea
***Professor, Dept. of Convergence Science and Technology, Graduate School of Venture, Hoseo University, Seoul 06724, Korea
****Director, Institute of Health Industry, Hoseo University, Seoul 06724, Korea
Corresponding author: Soon Ah Kang, Professor, Dept. of Convergence Science and Technology, Graduate School of Venture, Hoseo University, Seoul 06724, Korea. Tel: +82-2-2059-2353, Fax: +82-2-2059-1405, E-mail: sakang@hoseo.edu
25/08/2020 11/09/2020 23/09/2020

Abstract


This study provides data to explore functional medicinal food materials that can prevent adult diseases, and verified antioxidant and anti-inflammatory of each solvent fraction of the methanol extract of Salvia plebeia R. Br. in Korea. In the analysis of total phenol content, DPPH radical scavenging ability, and FRAP reduction ability as indicators of antioxidant activity, the methanol fraction and ethyl acetate fraction of the Salvia plebeia R. Br. group showed high antioxidant activity. Ethyl acetate fraction of Salvia plebeia R. Br. methanol extract also showed excellent antioxidative activity as compared with BHT. In the mouse macrophage line Raw 264.7 cells, the NO production ability by LPS treatment was significantly increased in the LPS treatment group compared to the untreated group. In inflammatory reactions induced by LPS treatment in Raw 264.7 cells, inflammatory cytokines (TNF-α, PGE2, IL-1β) and NO production were decreased in the EtOAc fraction and MeOH fraction of the methanol extract of Salvia plebeia R. Br. compared to the case of LPS treatment alone. The anti-inflammatory effect was proved by significantly inhibiting the production of inflammatory cytokines. The present results suggest that Salvia plebeia R. Br. supplementation is beneficial for the suppression of antioxidant and anti-inflammation.



배암차즈기(Salvia plebeia R. Br.)의 항산화 활성 및 항염증효과

이 영 애*,**, 강 순아***.****
*호서대학교 벤처대학원 융합과학기술학과 박사과정 학생
**호서대학교 보건산업연구소 연구원
***호서대학교 벤처대학원 융합과학기술학과 교수
****호서대학교 보건산업연구소 소장

초록


    서 론

    산업의 발달로 식생활의 변화 및 환경오염원들에 의하여 생성되는 활성산소는 세포구성성분에 영향을 미치면서 다양 한 질병 즉, 뇌졸중, 파킨슨병, 동맥경화, 심장질환, 소화기질 환, 염증, 노화, 자가면역질환 등을 일으킨다. 또한, 체내 염 증반응은 세포나 조직의 손상 혹은 박테리아와 곰팡이에 의 한 감염 시 재생하기 위한 생체 방어 반응과정으로 다양한 면역세포 혹은 염증 매개인자가 관여되어 염증매개물질 분 비, 체액 침윤, 조직파괴, 세포이동 등 복합적인 생리적 반응 을 일으키며, 부종, 발열, 홍반, 통증 등을 유발한다. 이러한 다양한 질환을 예방 및 치료하기 위해서 다양한 종류의 천연 물질에 함유된 항산화 물질 분리에 관심을 가지며 기능성실 험이 진행되고 있고, 약용식물자원에서 유용 천연물을 탐색 하여 고부가가치 천연 기능성 식품 및 천연약물 등의 원료로 사용하고자 연구가 지속적으로 이루어지고 있다. 특히, 천연 물질 혹은 약용작물의 기능성 성분으로부터 만들어진 식품이 나 약제는 부작용이 적어서 장기간 복용의 장점이 있다.

    배암차즈기(Salvia plebeia R. Br.)는 우리나라 전역에 특히, 개울가, 황무지 혹은 길가에 자생하는 꿀풀과(Labiatae)에 속 하는 식물이다. 한방에서는 전초를 한약으로 사용하기도 하 는데 향이 강하여 여지초, 나인초, 설견초로 명명하며 잎의 모양과 흡사하게 곰보배추 혹은 뱀배추로 불리기도한다(Bae 등 2007;Lim 등 2007). 배암차즈기는 떫은 맛, 쓴 맛, 매운 맛이 강하여 대중화되어있지는 않지만 주로 기침, 염증, 간 염, 천식 등에 효능이 있다고 알려져 있다(Jo 등 2010). 한의 학적으로 양혈산어, 청혈해옥, 이수소종 등의 효능이 있어, 인후종통, 폐열해수, 토혈, 뇨혈, 감모발열, 신염누종, 치질, 옹종창독, 습진소양 등을 치료한다고 하였다(Shin 등 2001). 배암 차즈기의 활성성분으로는 flavonoids, homo-plantaginin, nepetin- 7-glucoside, rosmarinic acid, hispidulin, eupafolin, luteolin, 플라보 노이드, 페놀성 물질, 사포닌, 불포화스테롤, 정유성분 등이 보고되었다(Shin 등 2001;Lim 등 2007;Qu 등 2009;Choi 등 2015;Jeon 등 2016).

    배암차즈기에 대한 생리활성 연구로는 일부 진행되어 항 균, 항산화, 간세포 보호효과, 항알레르기, 항염증효과가 있 다고 보고되어있다(Kamatou 등 2005;Lim 등 2007;Qu 등 2009;Kim 등 2014;Bae HS 2016). 호흡기와 관련된 항염증 생리활성 연구로는 호염기성 백혈병 세포(RBL-2H3 cell)에서 호흡기염증질환의 치료효과 및 주요 활성물질(rosmarinic acid, hispidulin, luteolin) 규명(Song 등 2017), 배암차즈기 잎의 RAW264.7 대식세포에서 염증 주요인자인 NO와 PGE2 생성 을 억제하였고 iNOS와 COX의 발현을 억제하면서 항염증효 과를 보였고(Qu 등 2009), 미세먼지 유도 기도염증 모델에서 배암차즈기의 염증성 사이토카인과 케모카인의 회복효과 관 찰로 호흡기 보호효과 규명(Song 등 2017), 마우스 호흡기 손 상 모델에서 기관지 수축억제 활성 및 거담활성으로 호흡기 질환 치료 개선효과(Shin 등 2019) 등을 보였다. 또한 배암차 즈기의 핵산 추출물의 그람양성균과 음성균에 대한 항균 및 항진균 효과(Shin 등 2001), 메탄올추출물의 아질산염 소거능 을 측정하여 우수한 항산화 활성 규명(Lim 등 2007), 핵산추 출물의 항암활성(Shin 등 2001), 배암차즈기 95% 에탄올 추 출물의 항염증, 항혈관신생, 진통효과(Jung 등 2009), 지방세 포분화 억제효과 및 지방 축적 저해 효과(Choi 등 2015;Won HR 2016;Kim 등 2017)가 보고되어 있다. 부위별 활성에서는 배암차즈기의 잎에서 플라본계의 약성에 의하여 항산화활성 이 높게 보고되었다. 항산화 활성지표인 SOD 유사 활성은 배암차즈기 잎추출물이 뿌리추출물보다 3배 높은 활성을 보 임으로써 기능성 소재로 활용시에 약용작물의 부위별에 따 른 차이도 고려해야한다(Choi 등 2014).

    염증반응은 면역반응으로, 면역세포가 세균 혹은 바이러 스 등에 노출되면 활성화 면역세포에서 염증인자가 발현되면 서 염증반응을 보이며(Wang 등 2002), 장기에 영향을 주면서 당뇨, 비만, 암, 심혈관질환, 치매 등에 영향을 준다(Hotamisligil GS 2017). 대식세포가 lipopolysaccharide(LPS) 자극에 의하여 inducible nitric oxide synthase(iNOS)가 발현되면 NO를 생성하 면서 염증반응을 보인다(Guzik 등 2003). Nitric oxide는 iNOS의 생성을 증가시키면서, 염증반응이 활성화되어 reactive oxygen species(ROS)를 생성하게된다(Guzik 등 2003). 염증매개물질 이 과량 생성되면 면역반응이 민감하게 일어나면서 질환을 악화시키게 되므로 염증 관련 유전자의 활성도를 억제할 수 있는 소재를 탐구하며 이는 다양한 형태의 질병 양상을 완화 시킬 수 있을 것이다. Kim 등(2009)의 연구에서는 길경의 용 매분획별 항염증활성을 ethyl acetate층과 butanol층이 항염증 효과가 있음을 보이면서 약성이 강한 분획층을 활용한다면 더 욱 향상된 기능성을 보일 것으로 보인다.

    따라서 항산화 및 항염증 기능을 가지면서 성인병 예방에 도움을 주는 건강기능성 식품 개발에 자료를 제공하고저 배 암차즈기의 최적 분리 조건을 확립하여 순수한 물질을 분리 하는 것이 필요하므로 본 연구에서는 국내산 배암차즈기로 부터 메탄올 추출물의 각각의 용매 분획에 대한 항산화 및 항염증을 검증함으로써 기능성 식품 소재로서의 활용에 도 움을 주고자한다.

    재료 및 방법

    1. 재료 및 추출물

    본 연구에 사용된 배암차즈기는 경남 함양군 일원에서 자 생하여 함양 약초시험장에서 재배된 것으로 지상부 부위를 채취 후 식물체는 음건하여 보관하면서 사용하였다. 농촌진 흥청 조강진박사로부터 받은 배암차즈기(Salvia plebeia R. Br.)의 음건 시료는 50℃ dry oven에서 완전 건조 후, 곱게 분 쇄하여 실온에서 80% methanol로 3회 반복하여 추출하며, 여 과지 Whatman No. 2로 여과하여 45℃ 수온을 유지하는 rotary vacuum evaporator를 사용하여 감압농축 하였다. 농축한 80% methanol 추출물을 동결건조한 후 계통 분획하였다. Methanol 추출물을 Hexane:H2O(1:1) 용매로 3~4회 분획한 후 얻어진 hexane 분획분을 감압 농축하였다. Methylene Chloride:H2O (1:1) 용매와 ethyl acetate: H2O(1:1) 용매의 순으로 계통분획 한 후 시료를 rotary vacuum evaporator로 감압 농축 후 용매별 fraction을 실험시료로 얻었다. Methanolic extract와 각각의 용 매 fraction에 대한 수율은 메탄올 추출물은 25.0%, hexane 층 은 2.5%, methylene chloride fraction은 2.4%, EtOAc fraction은 1.5%, water fraction은 69.5%이었다.

    2. 총 페놀 함량

    분획별 시료의 총 페놀 함량은 Folins-Denis(Kim 등 2003) 의 방법으로 측정하였다. 분획별 시료 0.25 mL에 증류수 4 mL를 넣고 혼합하여 증류수와 1:1의 비율로 희석한 Folin- Ciocalteau's(Fluka, Buchs, Switzerland) 시약 0.25 mL를 30초 동안 혼합한 후 5분간 반응시킨다. 반응용액에 포화상태인 sodium carbonate 0.5 mL를 첨가하여 30분 상온에서 반응하였 다. UV-VIS spectrophotometer(Shimadzu, Kyoto, Japan) 725 nm 에서 흡광도를 측정하여, 총 페놀 함량은 tannic acid를 표준 물질로 이용하여 작성한 표준곡선에서 tannic acid 당량으로 계산하였다.

    3. DPPH 라디칼 소거활성

    분획별 시료의 DPPH(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) 라디칼 소거활성 분석에 100% 메탄올을 이용하여 용해시킨 0.1 mM DPPH 용액 3.75mL에 분획별 시료용액 0.25 mL를 혼합하여 10초간 mixing 후 30분간 암소에서 반응시켰다. 30분 후에 UV-VIS spectrophotometer로 517 nm에서 측정하였다(Kim 등 2013). 대조군은 분획별 시료용액과 동량의 메탄올 용액을 혼합하여 실험 시료와 같은 과정으로 실험하였다. DPPH 라 디칼 소거활성능 판정은 대조군이 50% 라디칼을 소거할 수 있는 활성능력에 해당하는 시료의 양 (EC50, effective concentration) 으로 산출하였다.

    4. FRAP(Ferric reducing antioxidant power) 환원능

    낮은 pH에서 시료의 환원력 (ferric reducing ability)를 보는 방법으로 0.3M sodium acetate buffer(pH 3.6)와 40 mM HCl 혼 합액인 10 mM 2,4,6-tripyridyl-S-triazine(TPTZ) solution, 20 mM FeCl3 solution을 사용하였다. 실험직전에 신선하게 10: 1:1의 비율로 시약을 혼합하여 10~15분 동안 37℃에서 반응 후 FRAP 시약을 준비하였다(Jeong 등 2010). FRAP 시약 1.5 mL를 분획별 시료 0.05 mL에 혼합하여 30분간 상온에서 반 응 후, UV-VIS spectrophotometer를 이용하여 593 nm에서 흡광 도를 측정하였다. 시료의 FRAP 환원능은 ascorbic acid를 표준 물질로사용하여 ascorbic acid 당량으로 결과를 산출하였다.

    5. 마우스 대식세포 RAW 264.7 세포주 배양

    마우스 대식세포 RAW 264.7 세포주를 American Type Culture Collection(ATCC, Rockville, MD, USA)에서 구입하여, 배양은 Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM, Sigma- Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)에 100 U/mL penicillinstreptomycin( PS, Welgene Inc., Gyeongbuk, Korea)와 10% Fetal Bovine Serum(FBS, Sigma-Aldrich Co.)을 혼합하여 배지로 사 용하였다. 배양조건은 37℃에서 5% CO2 조건으로 조절한 배 양기에서 실험을 하였다. Amrouche 등(2006)의 방법을 수정 하여 진행하였다(Lee 등 2014).

    6. 생존율 분석

    마우스 대식세포 RAW 264.7 cell line을 96 well plate 위에 well 당 3×10⁵ cell/mL의 농도로 각각 배양하고 각 well 당 배 암차즈기 분획별 시료를 20 μL씩 첨가하고 37℃이며 5% CO2 incubator에서 24시간 배양시켰다. 배양한 후 MTT(3-[4,5-dimethylthiazol 2-yll)-2,5diphenyl tertrazolium bromide) 용액을 50 μ L씩 넣고 incubation을 4시간 지속한 후 MTT 용액을 제거한 후 150 μL씩 DimethylSulfoxide(DMSO)를 넣후 ELISA reader 로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

    7. Nitric oxide(NO) 농도 측정

    RAW 264.7 cell line의 배지에서 NO 농도는 Griess reagent (Sigma-Aldrich Co.)를 활용하여 측정하였다. 96-well plate에 well당 3×105 cell/mL 농도로 24시간 동안 배양한 후 2 μg/mL lipopolysaccharide(LPS, Sigma-Aldrich Co.)를 처리하고 필터 (0.2 μm, GVS Filteration Inc., Bloomer, WI, USA)를 통과한 배 암차즈기 분획별 시료의 농도를 0.1 mg/mL로 48시간 동안 처 리하였다. 세포 배양 상층액에 Griess reagent를 처리한 후, Wallac Victor3 1420 Multilabel Counter(Perkin-Elmer, Wellesley, MA, USA)로 흡광도를 550 nm에서 측정하였다(Livak & Schmittgen 2001).

    8. Prostaglandin E2 (PGE2) 생성 저해 활성능 측정

    RAW 264.7 대식세포를 96 well plate에 1.5×105 cells/well 농도로 분주하여 6시간 지난 후 배암차즈기 분액별 시료를 농도별(37.5, 75, 150 ng/mL)로 처리하고 LPS(75 ng/mL)로 염 증을 유도한 후 18시간 배양하였다. 상등액을 취해 PGE2를 측정하고저 PGE2 kit(R&D, Minneapolis, MN, USA)를 사용하 였다(Jeong 등 2012).

    9. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

    RAW 264.7 cell line을 96-well plate에 각 well당 3×105 cell/ mL 농도로 맞추어 37℃에서 24시간 동안, CO2 incubator에서 배양 후 배지는 제거하고 2 μg/mL LPS를 처리하고, 필터(0.2 μm, GVS Filteration Inc.,)를 통과한 배암차즈기 분획별 시료 0.1 mg/mL 농도로 48시간 동안 처리하였다. 세포 배양 상층액 을 ELISA kit(BioLegend, San Diego, CA, USA)로 IL-1β, TNF-α 의 농도를 측정하였다. 실험은 제조사에서 제공된 실험방법 을 준수하여 실험을 진행하였다(Livak & Schmittgen 2001).

    10. 통계처리

    모든 실험 결과는 평균±standard deviation(S.D.)로 표현하였 고 RT-qPCR은 평균±standard error(S.E.)로 나타내었다. Student t-test 분석과 one-way analysis of variance(ANOVA) 분석으로 검증하여 Duncan's multiple range tests로 군간의 통계적 유의 성을 판정하였으며, 유의성의 판단은 p value가 p< 0.05으로 하였다. 상관관계 분석은 p<0.05와 p<0.01 확률 수준에서 피 어슨의 상관계수(pearson’ correlation coefficient)를 구하여 검 정하였다.

    결과 및 고찰

    1. 총 페놀 함량 및 DPPH radical 소거능 분석

    배암차즈기(Salvia plebeia R. Br.)의 총 페놀함량을 정량한 결과 303.6±13.4 μg/g DW의 함량을 보였다(Table 1). 배암차 즈기(Salvia plebeia R. Br.)의 메탄올 추출물과 용매 분획별 free radical 소거능력을 측정한 결과는 Table 2에서 보는 바와 같이 배암차즈기의 에틸아세테이트 분획에서 항산화활성이 가장 크다는 것을 알 수 있었다. DPPH 라디칼 소거능은 에틸 아세테이트 분획이 SC50이 67 ug/mL로 나타났고, 메탄올 분 획이 SC50은 233 μg/mL로 나타나 에틸아세테이트 분획이 낮 은 농도에서 라디칼 소거능을 보였다. 또한 항산화표준물질 로 사용하는 BHT보다 높은 free radical 소거능을 보여 줌으로 써, BHA와 비교시 거의 동등한 활성이 있음을 보여주었다.

    약용식물로서 배암차즈기는 피토케미칼을 함유하고 있고 페놀성화합물 혹은 플라보노이드 성분을 다량 함유하고 있 고, 유지산화 억제 효과 및 DPPH 라디칼 소거능 등 항산화 활성이 높은 것으로 보고되어 있다(Kang 등 2003;Kamatou 등 2005;Lim 등 2007;Boo 등 2012;Jeong 등 2014;Han GY 2016). 특히 Jeong 등(2014)의 보고에 의하면 열풍 건조한 배 암차즈기의 총 플라보노이드와 총 폴리페놀 함량이 데친 후 에는 감소하였고, DPPH radical 소거능도 농도에 비례하게 데친 후 열풍 건조한 배암차즈기에서 유의하게 감소하는 결 과를 보임으로써 가공방법에 따라 항산화능의 차이가 있음 을 보여주었다. 한입버섯의 70% 에탄올추출물의 총 폴리페 놀 함량과 항산화지표인 DPPH 라디칼 소거능 및 아질산염 소거능과는 통계적으로 유의한 상관관계를 나타냈다(An 등 2019). 고지방-고콜레스테롤 식이를 공급한 흰쥐에게 배암차 즈기 열수추출물 급여가 glutathione peroxidase, glutathione reductase 활성이 증가하면서 간과 혈액의 과산화물 생성을 감소시켰다(Won HR 2016). Cho 등(2007)은 배암차즈기의 경 엽을 시료로 메탄올 추출액의 에칠아세테이트 분획에서 rosmarinic acid, hispidulin 7-O-glucopyranoside, luteolin 7-O-β- glucopyranoside 등을 동정하였고, rosmarinic acid의 항산화활 성능력이 가장 높은 것으로 보고하였다.

    2. FRAP 환원능력

    배암차즈기 추출물에 대한 ferric reducing ability(FRAP)를 측정한 결과 Table 3에서 보는 바와 같이 배암차즈기 에탄올 추출물의 환원력은 3.11±0.93 μg ascorbic acid/mg extract, 메 탄올 추출물의 환원력은 3.01±0.39 μg ascorbic acid/mg extract 으로 메탄올과 에탄올 추출물은 강력한 FRAP 환원력을 보였 다. 또한 배암차즈기 유기용매 분획층 모두에서 활성이 높게 나타났다. 이와 같이 항산화능력으로서 라디칼 소거능을 측 정할 수 있는 FRAP 환원능 분석에서 배암차즈기 분획별 항 산화력이 높은 것으로 나타났다.

    Jeong 등(2015)의 연구에서 배암차즈기 물 추출물이 강력 한 전자공여능을 보여주면서 천연항산화 소재 가능성을 시 사하였다. Lim 등(2007)의 연구에서는 배암차즈기 메탄올 추 출물에서 RC50 51.1 μg/mL 값으로 대조구인 BHT의 RC50 값 인 18.5 μg/mL와 비교할 때 합성항산화물에 비하여 배암차즈 기 추출물의 전자공여능력이 높은것으로 보고하였다. 배암 차즈기의 DPPH 수소공여능을 측정한 결과는 양성대조구인 아스코르븐산은 6.1 μg/mL의 RC50을, 배암차즈기는 16.9 μg/ mL의 RC50을 나타내었다. 또한, 배암차즈기 메탄올 추출물 은 linoleic acid에 대해 우수한 항산화력을 보이면서 기능성 식품소재 및 식품첨가물로써 활용가치가 있음을 시사하였 다. Choi 등(2014) 연구에서는 배암차즈기 잎과 뿌리의 에탄 올 추출물의 항산화능 지표인 DPPH radical과 ABTS radical 소거능이 시료 추출물 농도에 비례하여 유의적으로 증가함 에 따라 활성화 효과가 높은 결과를 보였고, SOD 유사 활성 은 잎이 뿌리보다 약 3배 높은 활성을 나타내었다. 본 연구의 결과에서도 항산화 활성능 지표로 총페놀함량, DPPH 라디칼 소거능 및 FRAP 환원능 분석에서 배암차즈기 메탄올 분획과 에틸아세테이트 분획에서 항산화력이 높은 것으로 나타났 다. 배암차즈기의 항산화능을 활용하여 기능성 식품소재의 활용가치를 시사하였으며 활성도를 높이기 위해서는 추출물 의 분획층을 활용할 수 있는 점을 시사하였다.

    3. Raw 264.7 세포에서 분획별 배암차즈기 추출물에 의 한 NO 생성능

    Raw 264.7 세포에서 NO 생성은 LPS 처리군이 LPS 미처리 군에 비해 통계학적으로 유의적으로 증가하였다(p<0.05)(Fig. 1). LPS 미처리군은 0.27±0.06 μg/mL이었고 LPS 처리군은 10.52±0.55 μg/mL로 통계적으로 유의하게 증가하였다(p< 0.05). 배암차즈기 분획별 시료 농도(37.5 ng/mL)로 처리 한 경우 LPS 처리군(10.52±0.55 μg/mL)에 비해 LPS 처리군 +EtOAc 분획(4.20±0.51 μg/mL)은 통계학적으로 유의적인 감 소가 있었고(p<0.05), 다른 분획별 배암차즈기 처리에 의해서 는 유의적인 차이가 없었다. 배암차즈기 분획별 시료 농도 (75 ng/mL)로 처리 한 경우 LPS 처리군(10.52±0.55 μg/mL)에 비해 LPS 처리군+MeOH 분획(6.88±0.29 μg/mL), LPS 처리군+ MeCl2 분획(5.58±0.50 μg/mL), LPS 처리군+EtOAc 분획(1.77± 0.29 μg/mL)은 통계학적으로 유의적인 감소가 있었고(p< 0.05), 배암차즈기 분획별 시료 농도(150 ng/mL)로 처리 한 경 우 LPS 처리군(10.52±0.55 μg/mL)에 비해 LPS 처리군+ MeOH 분획(2.38±0.04 μg/mL), LPS 처리군+MeCl2 분획(4.99 ±0.13 μg/ mL), LPS 처리군+H2O 분획(6.19±0.27 μg/mL), LPS 처리군 +EtOAc 분획(2.03±0.31 μg/mL)은 통계학적으로 유의적인 감 소가 있었고(p<0.05), 특히 헥산층을 제외한 모든 분획별 배 암차즈기 처리에 의해서는 LPS에 의한 세포독성을 감소시켜 주는 분획으로 실험시료의 농도를 150 ng/mL로 실험을 하였다.

    NO의 발생기전은 다양하지만 대식세포 등에서 생산하는 TNF-α, IL-1β 등의 염증성 cytokine들이 요인이 된다고 하였 다(Lee 등 2006;Jeon 등 2008;Chang 등 2009;Jo 등 2010;Jeong 등 2012). NO는 세포손상을 유도하여 염증을 유발하는 원인이 된다(Bae 등 2007;Jeon 등 2008;Jung 등 2009;Jeong 등 2012). Jo 등(2010)의 연구에 의하면 배암차즈기 추출물의 항염증 및 항알레르기 활성을 조사한 결과 대식세포에 LPS 자극 후 배암차즈기 처리 시 NO 및 염증성 cytokine(IFN-γ, IL-4, IL-2)의 생성이 억제되었다. 염증상태에서 과도한 NO의 생성은 염증반응을 촉진시켜 만성염증, 퇴행성 질환, 조직의 손상 및 유전자 변이 등의 원인으로 보고되어 있다(McCartney- Francis 등 1993;Hippeli & Elstner 1999;Bak 등 2011). Jeong 등(2015)의 연구에 의하면 NO 생성 저해 효과는 농도에 비의 존적으로 25~100 μg/mL 농도에서 대조군에 비하여 NO 생성 량이 30% 정도 감소하는 결과를 얻었으며, 물 추출물의 IC50 은 100 μg/mL 이상이었다. Jeong 등(2012)은 LPS로 자극을 준 RAW 264.7 대식세포에서 NO와 PGE2 활성, HO-1, iNOS, COX-2의 발현에 영향을 미치면서 염증반응을 유도하였다. 따라서 LPS 자극에 의한 RAW 264.7 대식세포로부터 염증관 련 물질인 NO, IL-6 및 TNF-α 등의 생성을 배암차즈기가 억 제함으로써 염증성 질환의 예방 혹은 치료에 유효한 효능을 기대해본다.

    4. Raw 264.7 세포에서 pro-inflammatory cytokine의 함 량 분석

    마우스 대식세포주 Raw 264.7 세포에 LPS를 처리하면 염 증이 유도되는데 배암차즈기 용매별 분획물 농도를 150 ng/ mL로 처리한 경우 pro-inflammtory cytokine(PGE2, IL-1β, TNF-α)의 함량 변화를 본 결과는 Fig. 2~Fig. 4에 보여준다. LPS 미처리군에 비하여 LPS를 처리한 군에서 PGE2, IL-1β와 TNF-α가 통계학적으로 유의하게 증가하였다(p<0.05)(Fig. 2). LPS 처리군(PGE2: 299.9±12.1 pg/mL, IL-1β: 1,799.5±44.2 pg/mL, TNF-α: 1,768.5±101.3 pg/mL)은 LPS 미처리군(PGE2: 48.6±2.9 pg/mL, IL-1β: 126.9±60.7 pg/mL, TNF-α: 106.3±3.0 pg/mL)보다 통계학적으로 유의하게 증가하였다(p<0.05). 이 는 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포주 염증 모델에서 LPS를 처리함에 따라 pro-inflammatory cytokine(PGE2, IL-1β, TNF- α) 함량이 증가됨을 보여주었다.

    LPS로 자극된 RAW 264.7 세포주 염증 모델에서 LPS를 처 리 시 증가된 pro-inflammatory cytokine(PGE2: 299.9±12.1 pg/mL, IL-1β: 1,799.5±44.2 pg/mL, TNF-α: 1,768.5±101.3 pg/ mL)에 배암차즈기 용매별 분획물을 처리한 결과는 Fig. 2와 같다. TNF-α 함량은 MeCl2 분획층을 제외한 다른 용매 분획 에서 모두 유의하게 감소하는 것을 볼 수 있었다. 특히 LPS 처리군+EtOAc 분획물(814.3±179.4 μg/mL)과 LPS 처리군+ MeOH 분획물(1,032.7±128.1 μg/mL)에서는 통계학적으로 매 우 유의하게 감소하였다(p<0.05)(Fig. 2). PGE2 함량은 배암차 즈기 전 분획층에서 유의하게 감소하는 것을 볼 수 있었으 며, 특히 LPS 처리군+EtOAc 분획물(103.8±11.7 μg/mL)과 LPS 처리군+MeOH 분획물(143.7±33.2 μg/mL)에서는 통계학 적으로 매우 유의하게 감소하였다(p<0.05)(Fig. 3). Prostaglandin E2는 염증반응을 유도하는 중요한 물질로 arachidonic acid가 cyclooxygenase(COX)에 의해 합성되며 염증반응과 함 께 부종, 홍반, 통증을 유발한다(Harris 등 2002). Jeong 등 (2012)의 연구에서 배암차즈기 잎 추출물의 PGE2 억제 활성 을 측정한 결과 LPS로 활성화된 PGE2는 20 ng/mL 수준으로 증가하였으나 배암차즈기 잎 추출물 농도에 의존하여 감소하 는 경향을 보였다. 배암차즈기의 생리활성 성분인 Salicylate metabolites인 sialic acid가 LPS로 자극한 대식세포의 NO생성 을 감소시키면서 PGE2 저해효과를 준 것으로 보고하였다 (Pang & Hoult 1997;Hinz 등 2000;Jo 등 2010).

    IL-1β 함량은 배암차즈기 H2O와 MeCl2 분획층을 제외한 다른 분획물에서 모두 유의하게 감소하는 것을 볼 수 있었 다. 특히 LPS 처리군+EtOAc 분획물(839.0±88.3 μg/mL)과 LPS 처리군+MeOH 분획물(1,026.7±154.6 μg/mL)에서는 통계 학적으로 매우 유의하게 감소하였다 (p<0.05)(Fig. 4). 이 결과 는 배암차즈기 EtOAc 분획물과 MeOH 분획물의 항염증 효 과를 증명하였고 시료를 준비할 때 분획층의 차이를 보여줌 으로써 효능의 극대화를 위해서는 EtOAc 분획물과 MeOH 분획물이 항염증 효과를 증가시키는 것으로 나타났다. 대식 세포를 활성화할 수 있는 LPS로 자극된 RAW 264.7 세포주 염증 모델이 항염증 모델로 널리 이용되므로, LPS를 처리하 면 iNOS가 발현되면서 NO 생성을 촉진하고 NO는 신경전달 반응 및 염증 반응을 유발하여(Miyasaka & Hirata 1997;Wang 등 2002), 염증관련 인자(IL-6, IL-1β, TNF-α, IFN-γ, COX-2, iNOS)가 급격하게 증가하여(Livak & Schmittgen 2001) 염증 반응이 활발해지면서 다양한 질환을 유발하여 악화시키는 원인이 된다(Seo 등 2000;Ahn 등 2009). 약용작물들에서 항 염증 소재를 탐색할 때 지표로 삼는 인자들은 NF-κB 활성을 억제하여 NO, IL-1β, IL-6의 생성을 억제하면서 항염증 효과 를 보였다(Lee & Rhee 2015). 따라서 본 연구에서는 배암차 즈기 용매별 분획물이 LPS로 자극된 RAW 264.7 식세포에서 농도 의존적으로 NO 생성량이 감소하였다.

    Jeong 등(2012)의 보고에 의하면 배암차즈기 추출물은 NO 와 PGE2 생성을 억제하였고, COX-2와 iNOS의 발현을 억제 하여 우수한 항염증 효과를 나타내었다. 이는 HO-1의 발현 을 증가시킴에 따라 산화적 손상으로부터 세포방어기작에 관여하는 항염증에 우수한 효과를 보였다. Shin 등(2016)의 연구에 의하면 배암차즈기 50% 주정 조추출물에서 용매별 분획물을 50 μg/mL의 농도에서 leukotriene 발현을 억제하는 결과를 보였고, ethyl acetate 분획물이 가장 높은 항염증 활성 이 나타남을 보였다. Qu 등(2009)은 Salvia plebeia의 주성분 인 homoplantaginin이 간보호 효과를 보이면서 LPS 처리 후 TNF-α, IL-1, IL-6 및 proinflammatory cytokine의 생성을 억제 하는 효과를 나타낸다고 보고하였다. Jo 등(2010)의 연구에 의하면 대식세포에 LPS 자극에 대하여 배암차즈기 추출물을 투여 시 NO와 염증성 싸이토카인(TNF-α, NO, IL-6)의 생성 이 억제되었다.

    본 연구결과에서도 배암차즈기 용매 분획별 시료 중 EtOAc 분획물과 MeOH 분획물의 염증성 싸이토카인(TNF-α, PGE2, IL-1β)의 생성이 유의하게 억제되면서 항염증 효과를 증명하였고 기능성 효능 실험에 분획층의 차이를 보여줌으로 써 생리활성의 극대화를 위해서는 EtOAc 분획물과 MeOH 분 획물이 항염증의 생리활성을 증가시키는 것으로 나타났다.

    5. 항산화효과 인자와 항염증효과 인자와의 상관관계 분석

    항산화효능 지표인 DPPH 라디칼소거능, FRAP 라디칼 소 거능과 염증반응의 지표물질인 PGE2, IL-1β 및 TNF-α 농도 의 상관성을 분석한 결과는 Table 4와 같다. DPPH 라디칼 소 거능(SC50)은 FRAP 활성(r=-0.6985, p<0.05)과는 유의한 상 관성을 보였고, NO 농도(r=-0.7044, p<0.05), PGE2 농도(r= 0.6915, p<0.05) 및 TNF-α 농도(r=0.8983, p<0.01)와는 각각 유 의한 상관관계를 나타내었다. PGE2 농도는 NO 농도(r= 0.8493, p<0.01), TNF-α(r=0.8883, p<0.01)와 각각 유의한 상관 성을 나타냈고, TNF-α 농도는 NO 함량(r=0.7870, p<0.01), PGE2(r=0.8883, p<0.01)와 유의한 상관관계를 보였으나 IL-1 β 농도와는 유의한 상관관계를 보이지 않았다. 본 연구결과 항산화 활성이 높은 시료일수록 항염증 효능을 보이는 것으 로 분석되었다.

    Bak 등의 연구에 의하면 염증 반응의 촉진제 역할이 활성 산소에 의하여 발생하므로 라디칼을 제거할 수 있는 시료가 항염증 효과도 높을 것으로 사료된다. 라디칼 소거능 활성은 총 폴리페놀 함량과 밀접한 관계가 있음을 보여주는 많은 연 구가 있었고(Qi 등 2013;An 등 2019) 본 연구에서는 DPPH 라디컬 소거능은 FRAP활성과는 유의한 상관성을 보였다. Kwak & Choi (2015)의 연구에서는 복숭아꽃 에탄올추출물의 항산화지표인 총 페놀화합물 함량과 항염증인자인 TNF-α 농 도만 유의한 상관관계를 보였고, PGE2, 아질산염, IL-6 농도 는 유의한 상관성을 보이지 않았다. 본 연구에서도 비슷한 경향성을 보였으나 TNF-α 농도와 PGE2는 유의한 상관관계 를 보였다.

    요약 및 결론

    본 연구는 성인병을 예방하며 항산화 및 항염증 기능을 보 이는 건강기능성 식품 소재를 탐구하는데 자료를 제공하고 저 국내산 배암차즈기 메탄올 추출물의 각각의 용매 분획에 대한 항산화 및 항염증 효과를 검증하였다. 항산화 활성능 지표로 총 페놀함량, DPPH 라디칼 소거능 및 FRAP 환원능 분석에서 배암차즈기 메탄올 분획과 에틸아세테이트 분획에 서 항산화력이 높은 것으로 나타났다. 배암차즈기의 항산화 능을 활용하여 기능성 식품소재의 항산화 효과 활용가치를 시사하였으며 활성도를 높이기 위해서는 추출물의 분획층을 활용할 수 있는 점을 시사하였다. 마우스 대식세포주 Raw 264.7 세포에서 LPS 처리에 의한 NO 생성능은 LPS 처리군이 LPS 미처리군에 비해 통계학적으로 유의적으로 증가하였다. 배암차즈기 분획별 활성에서 헥산층을 제외한 모든 분획별 에서 LPS에 의한 Raw 264.7 세포의 독성을 감소시켜주는 분 획으로 실험시료의 농도를 150 ng/mL로 실험을 하였다. 마우 스 대식세포주 Raw 264.7 세포에서 LPS 처리에 의해 유도된 염증반응에서 배암차즈기 용매별 분획물 농도를 150ng/mL 로 처리한 경우 EtOAc 분획물과 MeOH 분획물의 염증성 싸 이토카인(TNF-α, PGE2, IL-1β)의 생성이 유의하게 억제되면 서 항염증 효과를 증명하였다. 항산화효능 지표인 DPPH 라 디칼 소거능(SC50)은 FRAP 활성, NO 농도, PGE2 농도 및 TNF-α 농도와는 각각 유의한 상관관계를 나타내었다. TNF-α 농도는 NO 함량, PGE2와 유의한 상관관계를 보였으나 IL-1 β 농도와는 유의한 상관관계를 보이지 않았다. 본 연구결과 항산화 활성이 높은 시료일수록 항염증 효능을 보이는 것으 로 분석되었다. 기능성 효능 실험에 분획층의 차이를 보여줌 으로써 생리활성의 극대화를 위해서는 EtOAc 분획물과 MeOH 분획물이 항염증의 생리활성을 증가시키는 것으로 나 타났다.

    감사의 글

    본 논문은 2018년도 호서대학교의 재원으로 학술연구비 지원(2018-0303)을 받아 수행된 연구로 이에 감사드립니다. 또한, 본 논문의 소재인 배암차즈기와 분석재원을 제공해주 신 농촌진흥청 조강진박사님께 감사드립니다.

    Figure

    KSFAN-33-5-483_F1.gif
    Effects of fraction of Salvia plebeia R. Br. on LPS-activated nitric oxide released into the medium by RAW 264.7 cell.

    Each value is expressed as a mean S.D. (n=3). Cell were co-treated with LPS (75 ng/mL) and various fraction of Salvia plebeia R. Br. (37.5, 70 and 150 ng/mL) for 24hr. LPS, lipopolysaccharides; SA, Salvia plebeia R. Br. *p<0.05 compared to LPS(+) by t-test.

    KSFAN-33-5-483_F2.gif
    Effects of fraction of Salvia plebeia R. Br. on LPS-activated PGE2 released into the medium by RAW 264.7 cell.

    Each value is expressed as a mean S.D. (n=3). LPS, lipopolysaccharides; SA, Salvia plebeia R. Br. *p<0.05 compared to LPS(-) by t-test. Values with different letters above bar graphs are significantly different at the 5% level by one-way ANOVA and Duncan’s multiple range test.

    KSFAN-33-5-483_F3.gif
    Effects of fraction of Salvia plebeia R. Br. on LPS-activated IL-1β released into the medium by RAW 264.7 cell.

    Each value is expressed as a mean S.D. (n=3). LPS, lipopolysaccharides; SA, Salvia plebeia R. Br. *p<0.05 compared to LPS(-) by t-test. Values with different letters above bar graphs are significantly different at the 5% level by one-way ANOVA and Duncan’s multiple range test.

    KSFAN-33-5-483_F4.gif
    Effects of fraction of Salvia plebeia R. Br. on LPS-activated TNF-α released into the medium by RAW 264.7 cell.

    Each value is expressed as a mean S.D. (n=3). LPS, lipopolysaccharides; SA, Salvia plebeia R. Br. *p<0.05 compared to LPS(-) by t-test. Values with different letters above bar graphs are significantly different at the 5% level by one-way ANOVA and Duncan’s multiple range test.

    Table

    Total phenol contents (μg/g) using Folin-Dennis methods from Salvia plebeia R. Br.
    Each value represents mean±S.D., n=3.
    DPPH radical scavenging effects of five different solvent fractions from Salvia plebeia R. Br.
    <sup>1)</sup> Concentration of antioxidant required scavenging 50% of free radical (DPPH) in a reaction solution.
    DPPH: 2,2’-diphenyl-1-pycryl-hydrazil.
    Each value represents mean±S.D., n=3.
    Ferric reducing antioxidant power of the solvent fractions and methanol extracts derived from Salvia plebeia R. Br.
    Each value represents mean±S.D., n=3.
    Correlation coefficient among antioxidant activity and anti-inflammatory activity of Salvia plebeia R. Br.
    <sup>1)</sup> DPPH (SC<sub>50</sub>): DPPH: 2,2’-diphenyl-1-pycryl-hydrazil: Concentration of antioxidant required scavenging 50% of free radical (DPPH) in a reaction solution.
    <sup>2)</sup> FRAP : Ferric reducing antioxidant power.
    FRAP activity at 150 ng/mL.
    Significantly correlated each other at *<i>p</i><0.05 or **<i>p</i><0.01.

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