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ISSN : 1225-4339(Print)
ISSN : 2287-4992(Online)
The Korean Journal of Food And Nutrition Vol.32 No.5 pp.560-564
DOI : https://doi.org/10.9799/ksfan.2019.32.5.560

Effect of Pre-Treatment Methods on the Measurement of Probiotic Cell Count

Ju-Yeong Kang, Seo-Hyun Lee, Eun-Ji Park, Jung-Beom Kim*
Master’s Student, Major in Department of Food Science and Technology, Sunchon National University, Suncheon 57933, Korea
*Professor, Major in Department of Food Science and Technology, Sunchon National University, Suncheon 57933, Korea
Corresponding author: Jung-Beom Kim, Professor, Major in Department of Food Science and Technology, Sunchon National University, Suncheon 57933, Korea. Tel: +82-61-750-3259, Fax: +82-61-750-3208, E-mail: okjbkim@sunchon.ac.kr
08/08/2019 03/09/2019 16/09/2019

Abstract


The purpose of this study was to analyze the effects of the pre-treatment method on the measurement of probiotic cell counts. The probiotic cell count was not significantly different in the pre-treatment method such as experimenters, diluted solution, medium, and homogenization duration. The mean value of probiotic cell count with capsule was 2.2×1010±9.5×109 CFU/g. This probiotic cell count was converted into 2.8×1010±1.2×1010 CFU/g based on the net weight. The mean value of probiotic cell count without capsules was 4.3×1010±1.8×1010 CFU/g. As a result of this comparison, probiotic cell count showed significant difference with and without capsules. Thus, it is suggested that the probiotic cell count is measured by removing the capsule in capsule probiotics.



전처리 방법이 유산균수 측정에 미치는 영향

강 주영, 이 서현, 박 은지, 김 중 범*
순천대학교 식품공학과 대학원생
*순천대학교 식품공학과 교수

초록


    서 론

    ‘생명을 위한(for life)’이라는 의미를 가진 프로바이오틱 스(Probiotics)는 살아있는 미생물로 섭취하였을 때 장내 미생 물 균총을 조절하여 건강에 기여하는 것으로 보고되고 있다 (Lilly & Stillwell 1965;Wasilewski 등 2015). 또한 프로바이오 틱스는 식품 중 수분함량, 산소, 온도 및 산도에 매우 민감 하게 반응하며(Ahn YT 2014), 유산균, 효모, 기타 세균들로 구성되어 있으나, 대부분 유산균이 차지하고 있다(Ahn YT 2014). 유산균은 젖산균이라고도 하며, 포도당 또는 유당을 분해, 이용하여 유산을 다량 생성하며(Ljungh & Wadstrom 2009), 포자를 형성하지 않고 종류에 따라 그람 양성 또는 음 성이며, 간균이나 구균인 통성혐기성 세균이다(Yoon & Shin 2017). 대부분의 유산균은 미호기성, 내산성을 나타내는 것 이 많고, 인체에 유익한 작용을 하는 미생물이다(Baek YJ 1991). 현재까지 보고된 유산균은 300에서 400여 종이 있으 며, 약 20여 종이 발효산업에 이용되고 있다. 대표적인 유산균 종은 LactobacillusLactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus 그리고 모유를 섭취하는 유아 장내에 생육하는 부정형의 Bifidobacterium이 있다(Kim 등 2006). 프랑스의 미 생물학자 파스퇴르가 1858년 유산균을 처음 발견하였고(Lee JC 1991), 1907년 메치니코프가 유산균을 섭취하면 건강 장 수한다고 밝힘으로써 발효유의 과학적 효능이 입증되었다 (Metchnikoff & Yoo 2004). 또한 국내에서도 프로바이오틱 유 산균의 과민성대장증후군 개선 효과 등 다양한 연구가 진행 되고 있다(Ann 등 2013).

    국내 유산균제품 판매규모는 약 1,000억 원으로 기능성 식 품 중 매출액이 작은 수준이지만 고령화 사회로 진입한 국내 인구구조상 성장이 예측되고 있다(Park JS 2014). 2017년 건 강기능식품 총매출액 2조 1,297억 원 중 유산균 제품의 매출 액은 1,801억 원으로 홍삼제품 1조 19억 원, 비타민 제품 2,165 억 원에 이어 3위로 보고되고 있다(Ministry of Food and Drug Safety 2018a). 또한 2017년 건강기능식품 수출액 1,077억 원 중 유산균제품이 361억 원으로 가장 큰 비중을 나타내고 있 다(Ministry of Food and Drug Safety 2018a). 유산균제품 시장 이 확대됨에 따라 부작용 추정 사례 또한 증가하고 있으며, 2014년 355건이 신고되어 건강기능식품 중 부작용 추정 신 고가 가장 많은 제품 중 하나로 보고되고 있다(Ministry of Food and Drug Safety 2016). 이러한 부작용의 원인으로 유산 균의 체내 생존율을 높이기 위해 제조업체에서 유산균수를 표시량보다 약 3~5배 정도 더 첨가하기 때문인 것으로 분석 되고 있다. 유산균 과량 첨가에 따른 문제점을 해결하기 위 하여 유산균을 캡슐화하여 제조하는데 캡슐화란 주로 혐기 적 상태에서 활성을 나타내는 유산균을 캡슐에 넣어 혐기상 태를 제공하여 장내 생존율을 높이는 방법으로 각광을 받고 있다(Kim 등 2013).

    캡슐 유산균 제품의 정량실험 방법은 건강기능식품공전 공통 기준 및 규격에 “기준 및 규격은 캡슐기제를 제외한 내 용물에 대하여 적용한다. 단, 미생물실험은 제외한다.”라고 되어 있어 캡슐 유산균 제품의 유산균수 정량실험은 캡슐을 포함하여 실험하고 있다(Ministry of Food and Drug Safety 2018b). 그러나 실험 후 캡슐 무게를 제외하는 방법이 정확히 규정되어 있지 않아 실험자간 혼란을 야기하고 있다. 또한 유산균수 실험이 대장균군과 같은 위해미생물 실험이 아니 라, 기능성 물질의 품질을 평가하는 것이기 때문에 전처리 시 실험자에 따라 캡슐을 제거하고 실험하는 경우가 있다. 따라서 본 연구에서는 캡슐 포함 여부 등 전처리 방법이 유 산균수 측정에 미치는 영향을 분석하여 가장 정확한 전처리 방법을 제시하고자 하였다.

    재료 및 방법

    1. 실험재료

    본 실험에 사용한 재료는 GNC사의 프로바이오틱스 콤플렉스 를 사용하였으며, 이 제품에는 Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus acidophillus, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium animalis subsp. lactis로 총 4가지의 유산균이 함유되어 있다.

    2. 시료전처리

    A, B, C 3명의 실험자가 캡슐을 제거하지 않은 프로바이오 틱스 제품과 캡슐을 제거한 프로바이오틱스 제품 각각 25 g 을 전자저울로 정밀히 달아 멸균생리식염수 225 mL와 펩톤 식염완충액 225 mL를 가하여 균질기(BagMixer®400, Interscience, St Nom, France)로 1분, 3분, 5분, 10분간 균질화하여 시험 원액으로 하였다. 시험 원액을 10단계 계단 희석하여 시험 용액으로 하였다.

    3. 유산균수 측정

    유산균의 정량 실험은 건강기능식품공전에 따라 실험하 였다(Ministry of Food and Drug Safety 2018b). de Man, Rogosa, Sharpe agar(MRS, MBcell, Seoul, Korea)와 glucose Blood Liver agar(BL, MBcell)를 모두 사용하였으며, MRS agar를 이 용한 실험방법에서는 각각의 시험용액 1 mL를 페트리디쉬 에 가한 후, MRS 배지 약 15 mL를 분주하여 굳힌 뒤 5 mL를 중첩시켜 확산집락의 생성을 방지하였다. BL agar를 이용한 실험방법에서는 페트리디쉬에 BL agar를 붓고 굳힌 뒤 각 각의 시험용액 0.1 mL를 접종하여 멸균 초자봉으로 스프레 딩 하였다. 시료가 접종된 페트리디쉬는 37℃에서 72시간 혐 기 배양하였다. 각각의 실험자가 캡슐 유무, 배지종류, 희석 액, 균질화 시간에 따라 실험한 결과 값을 이용하여 평균과 표준편차를 계산하였다.

    4. 통계처리

    통계처리는 SPSS V25(SPSS Inc, Chicago, IL, USA)를 이 용하여 수행하였으며, 독립표본 t-test와 일원배치분산분석 으로 집단 간의 평균값을 비교하여 p<0.05 수준으로 Duncan 다중범위검정으로 사후검정을 실시하여 각각의 조건에서 유 산균 수의 유의적인 차이를 비교하였다.

    결과 및 고찰

    전처리 방법에 따른 캡슐 유산균 제품의 유산균수를 비교 하였다. 실험자에 따른 유산균수를 비교해본 결과, 2.9×1010± 9.6×109 CFU/g, 3.6×1010±1.9×1010 CFU/g, 3.2×1010±2.3×1010 CFU/g으로 A, B, C 세 실험자 모두 유산균수의 유의적인 차 이는 나타나지 않았다(Table 1). 희석액에 따른 유산균수를 비교해본 결과, 희석액으로 Saline을 사용 시 3.1×1010±2.1×1010 CFU/g이었으며, Buffered Peptone Water(BPW)를 사용 시 3.3×1010±1.5×1010 CFU/g으로 나타났다. 본 실험 결과, Saline 과 BPW 모두 유산균수의 유의적인 차이는 나타나지 않았다 (Table 2). 배지에 따른 유산균수를 비교해본 결과 BL Agar 를 사용 시 3.0×1010±1.4×1010 CFU/g이었으며, MRS Agar를 사용 시 3.4×1010±2.1×1010 CFU/g으로 유산균수의 유의적인 차이는 나타나지 않았다(Table 3). 균질 시간에 따른 유산균 수를 비교해본 결과, 1분에서 3.2×1010± 1.4×1010 CFU/g, 3분에 서 3.6×1010±2.4×1010 CFU/g, 5분에서 3.0×1010±1.1×1010 CFU/g, 10분에서 3.1×1010±2.1×1010 CFU/g으로 나타나 유산균수의 유 의적인 차이는 나타나지 않았다(Table 4). 캡슐 유무에 따른 유산균수를 비교해본 결과, 캡슐을 제거하지 않고 실험한 결 과, 유산균 수는 2.2×1010±9.5×109 CFU/g으로 나타났고, 이 결 과를 캡슐을 제외한 내용물의 유산균 수로 변환하면 2.8×1010± 1.2×1010 CFU/g으로 나타났다. 캡슐을 제거하고 내용물만 실 험한 결과, 유산균 수는 4.3×1010±1.8×1010 CFU/g으로 나타나 캡슐을 제거하지 않고 실험한 후 내용물의 유산균 수로 산술 계산한 결과와 유의적인 차이를 나타내었다(Table 5). 또한 시료에 표기된 유산균수 1.0×1010 CFU/280 mg을 g당 유산균 수로 환산하면 약 3.6×1010 CFU/g으로 나타났으며, 캡슐을 제거하고 실험한 경우만 표시 기준을 만족하였다.

    본 실험 결과, 실험자, 희석액, 배지, 균질화 시간에 따른 유산균수의 유의적인 차이는 나타나지 않았고, 캡슐 유무에 따른 유산균수는 유의적인 차이를 나타내었다. 유산균수 실 험방법은 건강기능식품공전에 준하였으며, 실험의 정확성 을 높이기 위해 식품의약품안전평가원의 시험법 가이드라 인을 참고하였다(National Institute of Food and Drug Safety Evaluation 2016). 식품의약품안전평가원의 미생물 시험법에 대한 검증 가이드라인에 따르면 실험실내 검증과 실험실간 검증이 필요하며, 두 검증 방법은 참여 실험실 수의 차이를 제외하고 분석 시료 1개 이상, 분석 시료 별 반복수 2회 이상 의 검증절차에 따른 실험을 요구하고 있다(National Institute of Food and Drug Safety Evaluation 2016). 본 실험은 이러한 기준에 준하여 분석 시료 1개 이상, 분석시료 별 반복수를 3회 이상으로 설정하였으며, 실험실간 검증을 대신하여 실 험자를 3명으로 설정하여 실험의 정확도를 높이고자 하였다. 본 실험 결과, 균질화 시간을 1분 이상으로 하여 배지, 희석 액 등은 공전에서 제시된 어떠한 방법을 사용해도 유산균수 의 유의적인 차이는 나타나지 않았다.

    캡슐 유무에 따른 유산균수에서는 캡슐을 제거하지 않고 실험한 유산균수의 결과 값과 캡슐의 무게를 제외하고, 내용 물에 대한 유산균수로 산술적 계산하여 도출한 유산균수의 결과 값, 캡슐을 제거하고 실험한 유산균수의 결과 값을 비 교하였다. 산술적으로 계산한 결과 값이라 함은 캡슐을 포함 25 g을 측정하였을 때 제거된 캡슐의 무게가 평균 5.4 g을 나타내었다. 이 값을 이용하여 캡슐을 제거하지 않고 시료 25 g을 채취하였을 경우, 25 g에서 5.4 g을 제외한 19.6 g을 내용물의 무게로 산정하여 유산균 수를 계산하였다. 기능식 품공전에 유산균수 측정은 캡슐을 제거하지 않고 시료를 취 하도록 명시되어 있으나, 명시된 시험법대로 실험을 하면 캡 슐을 제거하고 내용물만 가지고 실험한 결과 값보다 유산균 수가 적게 측정되었다. 따라서 캡슐 유산균 제품의 유산균수 를 측정할 경우, 캡슐을 제거하고 내용물만을 실험대상으로 하여 측정하는 것을 고려하고, 본 실험 결과가 1개 실험실의 한정적인 측정값임을 감안하여 건강기능식품 공전 중 유산 균수 실험법 개선을 위해 다수의 실험실이 참가한 검증 및 개선이 필요한 것으로 판단된다.

    요약 및 결론

    본 연구에서는 전처리 방법이 유산균수 측정에 미치는 영 향을 분석하여 가장 정확한 전처리 방법을 제시하고자 하였 다. 본 실험에 사용된 재료는 시중 유통 중인 유산균 제품을 대상으로 하였으며, 건강기능식품공전에 따라 실험하였다. 전처리 방법 중 실험자, 희석액, 배지, 균질화 시간 등에 따른 유산균수의 유의적인 차이는 나타나지 않았다. 그러나 캡슐 유무에 따른 유산균 수를 비교해본 결과, 캡슐을 제거하지 않고 실험한 결과, 유산균 수는 2.2×1010±9.5×109 CFU/g으 로 나타났고, 이 결과를 캡슐을 제외한 내용물의 유산균 수 로 변환하면 2.8×1010±1.2×1010 CFU/g으로 나타났다. 캡슐 을 제거하고 내용물만 실험한 결과, 유산균 수는 4.3×1010± 1.8×1010 CFU/g으로 나타나 캡슐을 제거하지 않고 실험한 후 내용물의 유산균 수로 산술 계산한 결과와 유의적인 차이가 나타났다. 캡슐 유산균 제품의 유산균수를 측정할 경우, 캡 슐을 제거하고 내용물만을 실험대상으로 하여 측정하는 것 을 고려하고, 본 실험 결과가 1개 실험실의 한정적인 실험값 임을 감안하여 다수의 실험실이 참가한 검증 및 개선이 필요 한 것으로 판단된다.

    감사의 글

    본 실험에 사용된 프로바이오틱스 제품을 제공해 준 동원 F&B사에 감사드립니다.

    Figure

    Table

    Comparison of probiotic cell counts according to the experimenters
    Comparison of probiotic cell counts according to diluted solution
    Comparison of probiotic cell counts according to medium
    Comparison of probiotic cell counts according to homogenization time
    Comparison of probiotic cell counts according to capsule

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