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ISSN : 1225-4339(Print)
ISSN : 2287-4992(Online)
The Korean Journal of Food And Nutrition Vol.32 No.5 pp.511-521
DOI : https://doi.org/10.9799/ksfan.2019.32.5.511

Enzyme Inhibitory and Anti-Proliferation Effects of Peanut Skin Extracts Depending on Cultivar

Min Young Kim, Hyun-Joo Kim*, Yu-Young Lee*, Mi Hyang Kim*, Jin Young Lee*, Byoungkyu Lee**,Byong Won Lee*
Post-Doctor, Department of Central Area Crop Science, National Institute of Crop Science, Rural Development Administration, Suwon 16613, Korea
*Researcher, Department of Central Area Crop Science, National Institute of Crop Science, Rural Development Administration, Suwon 16613, Korea
**Senior Researcher, Department of Central Area Crop Science, National Institute of Crop Science, Rural Development Administration, Suwon 16613, Korea
Corresponding author: Byong Won Lee, Researcher, Department of Central Area Crop Science, National Institute of Crop Science, Rural Development Administration, Suwon 16613, Korea. Tel: +82-31-695-0625, Fax: +82-31-695-0609, E-mail: bwlee@korea.kr
19/09/2019 04/10/2019 14/10/2019

Abstract


The purpose of this study was to investigate the inhibitory effect of enzyme activity and anti-proliferation of human cancer cell lines (HCT 116, NCI-H460 and MCF-7) of peanut skin depending on cultivars (Arachis hypogaea L. cv. K-Ol, cv. Sinpalkwang, cv. Daan, cv. Heuksaeng) and extraction solvent. Peanut skin was extracted with 80% ethanol, 80% methanol, 80% acetone, and distilled water, followed by analysis of the enzyme inhibitory activity and anticancer activity. Methanol extract of Daan cultivar most effectively inhibited α-gluosidase (65.08%, 0.025 mg/mL), tyrosinase (82.49%, 2 mg/mL) and ACE (73.61%, 10 mg/mL). The inhibitory effect of peanut skin extracts on colon cancer cell (HCT-116), lung cancer cell (NCI-H460) and breast cancer cell (MCF-7) growth were investigate using MTT assay. The highest anti-proliferation of cancer cell line of peanut skin extracts was observed in the methanol extract of Daan cultivar. The cell viability on HCT 116, NCI-H460 and MCF-7 cell lines of methanol extracts from peanut skin of Daan cultivar was 48.13%, 41.03%, and 36.02% at 200 μg/mL, respectively. These results suggest that peanut skin extracts may mediate physiological activity, and provide valuable information for the use of peanut byproduct as a functional food material.



품종별 땅콩 종피 추출물의 효소저해활성 및 암세포주 증식억제 효과

김 민 영, 김 현주*, 이 유영*, 김 미향*, 이 진영*, 이 병규**, 이 병 원*
국립식량과학원 중부작물부 수확후이용과 전문연구원
*국립식량과학원 중부작물부 수확후이용과 농업연구사
**국립식량과학원 중부작물부 수확후이용과 농업연구관

초록


    서 론

    땅콩(Arachis hypogaea L.)은 장미목(Rosales) 콩과(Fabaceae) 에 속하는 1년생 초본 식물로 문헌에서 전해지는 역사적 기원 은 남아메리카 열대지역에서 오래(약 B.C. 950년)전부터 재 배되어 왔다고 알려져 있다. 땅콩의 높은 유지 함량으로 인 해 유지원료 작물로 재배되며, 식용 기름으로 이용되거나, 단백질 공급을 위한 식품 급원으로 가공처리를 하지 않은 상 태의 땅콩으로의 섭취가 이루어지고 있다(Woodroof 1973;Woodroof 1983). 농촌진흥청에서는 땅콩에 대한 연구로 수량 성이 높고 재배가 쉬우면서 품질이 우수한 신팔광(Pae 등 2016a) 및 다안(Pae 등 2017a), 올레산 함량이 82% 이상 함유 된 기능성 품종인 케이올(Pae 등 2016b), 안토시아닌 함량이 높은 품종인 흑생(Pae 등 2017b)등 60여 종의 땅콩 품종을 육 성하였으며, 품종별 유지의 지용성 영양성분, 산화 안정성 및 이화학적 특성에 대한 연구(Lee 2001;Lim 등 2017)와 함께 땅콩의 기능성에 대한 연구는 종자를 중심으로 진행 되었다.

    특히 땅콩이 가진 높은 불포화지방산 조성은 혈중 저밀도 지질단백질(LDL)-콜레스테롤 함량을 감소시키며, 땅콩 유지 내 식물성 스테롤은 장내 콜레스테롤 흡수를 저해하고, 지용 성 비타민의 하나인 tocopherol은 체내 활성산소를 소거하여 유리라디칼 및 과산화 지질의 생성을 억제한다고 알려져 있 다(Ricciareli 등 2001;Ostund 등 2002;Sabat 등 2010). 그 밖에도 땅콩에는 resveratrol(3,5,4ˊ-trihydroxystilbene), coumaroyl-rhamnose, p-coumaric acid 유도체를 비롯한 폴리페놀 화합물이 2차 대 사산물로서 존재하며(Limmongkon 등 2017), 그 중에서도 resveratrol은 항산화 활성과 함께 UV-B에 의해 멜라닌 생성 이 유도된 흑생종 세포내에서 tyrosinase 활성과 멜라닌 생성 을 효과적으로 저해한다는 연구결과가 보고되었다(Lee 등 2014).

    땅콩을 비롯한 브라질너트, 헤이즐넛, 아몬드 등과 같은 유지작물의 종피는 종자에 비해 작은 비중을 차지하지만, 페 놀산, 안토시아닌, 프로시아니딘 및 프로안토시아니딘 중합 체 등의 페놀화합물을 다량 함유하고 있는 것으로 알려져 있 으며(Yen 등 2005), 그 중 땅콩 종피는 추출용매에 따라 115∼ 149 mg/g의 페놀화합물이 존재한다고 보고되었다(Nepote 등 2005). 특히, 본 연구에서 사용한 케이올, 신팔광 및 다안과 같은 적땅콩 종피의 주요 성분은 procyanidin dimer, trimer 및 tetramer 등의 procyanidin oligomer와 catechin, epicatechin, luteoln, quercetin 등의 monomeric flavonoids이며(Yu 등 2006), 흑생과 같은 흑땅콩 종피의 주요 성분은 cyanidin-3-O-sophoroside (C3So), cyanidin-3-sambubioside(C3Sa), cyanidin-3-O-glucosylrutinoside 및 cyanidin-3-O-xylosylrutinoside 등의 안토시아닌 계열로 알 려져 있지만(Zhao 등 2017), 땅콩 종피 추출물의 생리활성에 대한 연구는 항산화(Oldoni 등 2016) 및 항균활성(De Camargo 등 2017b)에 대해서 한정적으로 진행되었다.

    이와 같이 땅콩의 생리활성에 대한 연구는 불포화 지방산 과 resveratrol 함량이 높은 땅콩종자를 중심으로 이루어져 있 으며, 땅콩 종피의 구성성분은 구명되었지만, 생리활성에 대 한 연구는 상대적으로 부족한 실정이다. 따라서 본 연구에서 는 품종별 땅콩 종피의 추출용매에 따른 효소저해활성 및 암 세포주 억제 활성을 검토하여 기능성 식품소재 개발을 위한 기초자료를 제공하고자 하였다.

    재료 및 방법

    1. 실험재료 및 추출물 제조

    본 연구에서 사용된 땅콩 품종은 2018년에 전라북도 전주 소재의 국립식량과학원에서 생산된 케이올(Arachis hypogaea L. cv. K-Ol), 농업기술실용화재단에서 구입한 신팔광(cv. Sinpalkwang), 고창이엠푸드에서 생산된 다안(cv. Daan)과 흑생(cv. Heuksaeng) 품종을 사용하였다. 땅콩 종피 추출물을 제조하기 전에 품종별 시료는 종피와 종자를 분리한 후 분쇄기(Hanil Co., Kangwon, Korea)를 사용하여 분쇄하여 추출 시료로 사용하였다. 땅콩 종피는 시료 중량 대비 10배량의 80% 에탄올(v/v), 80% 메탄 올(v/v), 80% 아세톤(v/v) 및 증류수(v/v)를 첨가하여 1시간동 안 3회 반복하여 초음파 추출하고, 이 추출물을 여과, 감압농 축 및 동결건조하였으며, 추출물을 100 mg/mL의 농도로 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 용해한 후 증류수 및 배지 (DMEM, Gibco Co.)로 희석하여 생리활성 측정용 시료로 사 용하였다.

    2. α-Glucosidase 저해활성 측정

    α-Glucosidase 저해활성은 Tibbot와 Skadsen(1996)의 방법 에 따라 측정하였다. α-Glucosidase(Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)와 p-NPG(p-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside, Sigma-Aldrich Co.)는 0.1 M sodium phosphate buffer(pH 7.0)에 용해하여 사용하였으며, 10 mg/mL 농도의 추출물 50 μL를 0.35 unit/mL α-glucosidase 효소액 100 μL와 혼합하여 37℃에 서 10분간 전배양한 후 1.5 mM ρ-NPG 50 μL를 가하여 37℃ 에서 20분간 반응시켰다. 1 M Na2CO3 1 mL를 가하여 반응을 정지시킨 후 405 nm에서 흡광도를 측정하고 저해율(%)을 계 산하였으며, positive control로 acarbose(Sigma-Aldrich Co.)를 사용하였다.

    3. Tyrosinase 저해활성 측정

    Tyrosinase 활성은 Kubo 등(1994)의 방법을 변형하여 사용 하였다. 반응액의 총 부피는 300 μL이며, 0.07 M sodium phosphate buffer 180 μL, 5 mg/mL 농도의 각 추출액 30 μL, 0.1 mM L-3,4-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA, Sigma-Aldrich Co.) 40 μL, tyrosinase(Sigma-Aldrich Co.) 50 μL를 넣고 25℃ 에서 10분 동안 반응시킨 후 475 nm에서 흡광도를 측정하고 저해율을 계산하였으며, positive control로 kojic acid(Sigma- Aldrich Co.)를 사용하였다.

    4. Angiotensin converting enzyme I (ACE) 저해활성 측정

    ACE(Angiotensin I Converting Enzyme) 저해활성은 Cushman과 Cheung(1971)의 방법으로 다음과 같이 실시하였다. Hippuryl-Lhistidyl- L-leusine(HHL, Sigma-Aldrich Co.) 25 mg을 0.1 M sodium borate buffer(pH 8.3)에 용해하여 제조한 기질 30 μL에 10 mg/mL 농도의 시료 10 μL를 가하여 37℃에서 10분간 반응 하였다. 그 다음 효소 Angiotensin Converting Enzyme(0.5 unit/mL, Sigma-Aldrich Co.) 10 μL를 첨가하여 37℃에서 30분 간 반응한 다음 1 N HCl 50 μL를 첨가하여 반응을 종료하였 다.그 후 모든 처리군에 ethyl acetate 300 μL를 첨가한 다음 원심분리기를 이용하여 원심분리를 한 후 상층액 250 μL를 취해서 70℃에서 1시간 동안 방치하였다. 그 다음 증류수 300 μL를 첨가하여 교반 후 228 nm에서 흡광도를 측정하고 저해율을 계산하였으며, positive control로 enalapril maleate (Sigma- Aldrich Co.)를 사용하였다.

    5. 암세포주 배양

    본 실험에서 사용한 암세포는 NCI-H460(lung cancer cell), HCT-116(colon cancer cell) 및 MCF-7(breast cancer cell)를 한 국세포주은행에서 분양받아 사용하였다. 각각의 세포는 10% fetal bovine serum(FBS, Gibco Co., Carlsbad, California, USA)과 100 U/mL penicillin G, 50 μg/mL streptomycin을 첨가한 DMEM 배지(Gibco Co.)를 사용하여 5% CO2, 37°C 배양기(EYELA, Vision scientific Co., Daejeon, Korea)에서 배양하였으며, 세포 밀도가 높아지면 5분간 trypsin-EDTA를 처리하여 계대배양 을 실시하였다.

    6. 세포독성 측정

    땅콩 종피 추출물의 세포독성은 일반세포인 3T3-L1 cell을 이용하여 Ishiyama 등(1996)의 방법에 따라 MTT(3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay를 이용하여 측정하였다. 3T3-L1 cell은 한국세포주은행에서 분 양받아 사용하였으며, 1×105 cell/well 농도로 96 well plate에 100 μL씩 분주한 후 37°C, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양 하였다. 시료는 일정농도가 되도록 DMSO로 희석하여 사용 하였으며, 배양에 사용된 배지를 제거하고 배지에 일정농도 로 희석된 시료를 첨가하여 다시 24시간 배양하였다. 배양 완료 후 2 mg/mL 농도의 MTT 시약을 well당 10 μL씩 첨가한 다음 37°C, 5% CO2 배양기에서 4시간 후 MTT 시약이 포함 된 배지를 제거하고, DMSO 100 μL를 가한 후 상온에서 발색 시키고, ELISA microplate reader(ELx 808, Bio-Tek Inc., Winooski, VT, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 각의 세포독성은 세포생존률로 표시하였고, 3T3-L1 cell에서 세포독성을 나타내지 않는 농도범위 내에서 암세포주 성장 억제 효과를 측정하였다.

    7. 암세포주 성장억제 효과 측정

    땅콩 종피 추출물의 암세포 성장억제 효과를 측정하기 위 해 Ishiyama 등(1996)의 방법에 따라 MTT assay로 측정하였 다. 즉, 각각의 암세포주를 1 × 105 cell/well 농도로 96 well plate에 100 μL씩 분주한 후 37oC, 5% CO2 배양기에서 24시 간 배양하였다. 전 배양에 사용된 배지를 제거하고, 배지에 일정농도로 희석된 물 및 추출물 100 μL를 첨가하여 다시 24 시간 배양하였다. 배양 완료 후 2 mg/mL 농도의 MTT시약을 well당 10 μL씩 첨가한 다음 37°C, 5% CO2 배양기에서 4시간 후 MTT 시약이 포함된 배지를 제거하고 dimethyl sulfoxide (DMSO) 100 μL를 가한 후 상온에서 발색시키고, ELISA microplate reader(ELx808, Bio-tek Inc., Winooski, VT, USA) 를 이용, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 암세포증 식 억제율은 생존율로 표시하였다.

    8. 통계분석

    통계분석은 SPSS 통계프로그램(Statistical Package for the Social Science, Ver. 12.0 SPSS Inc., Chicago, USA)을 이용하여 각 측정군의 평균과 표준편차를 산출하고, 품종간의 차이 유 무를 one-way ANOVA(analysis of variance)로 분석한 뒤 신뢰 구간 p<0.05 에서 Duncan’s multiple range test를 이용하여 유 의성을 검정하였다.

    결과 및 고찰

    1. α-Glucosidase 저해활성

    추출용매에 따른 품종별 땅콩 및 탈지땅콩 추출물의 α -glucosidase 저해활성을 측정한 결과는 Fig. 1과 같다. 양성대조군 으로 사용한 acarbose는 0.25 mg/mL의 농도에서 47.78%의 α-glucosidase 저해활성을 나타내었다. Acarbose는 N-butyldeoxynojirimycin 과 함께 탄수화물 분해 관련 효소를 억제하여 식이 후 혈당 상승을 조절할 수 있는 합성 약물로서, Kim 등(2015)의 연구 에서는 acarbose와 N-butyldeoxynojirimycin이 α-glucosidase 저 해활성에 대한 IC50값이 각각 447.73 및 569.80 μg/mL로 측정 되었다고 보고하였다. 땅콩 종피 추출물의 α-glucosidase 저해 활성은 다안 품종이 0.025 mg/mL의 농도에서 34.13~65.08% 로 가장 높게 나타났으며, 케이올, 신팔광 및 흑생은 동일농 도에서 각각 31.70~60.59%, 29.49∼56.90% 및 17.87~47.17% 범위로 품종에 관계없이 모든 추출물에 acarbose보다 10배 낮 은 농도에서 유사한 범위의 α-glucosidase 저해활성을 보였다. 또한 추출용매에 따른 땅콩 종피 추출물의 α-glucosidase 저 해활성은 메탄올 추출물이 47.47~65.08% 범위로 가장 우수한 저해활성을 보였으며, 에탄올 추출물(39.79~53.99%), 아세톤추 출물(34.26~51.63%), 물 추출물(17.87~34.13%)의 순서로 높게 나타났다. 즉, 땅콩 종피를 80% 메탄올 및 에탄올로 추출하 였을 때 다안품종의 α-gucosidase 저해활성이 각각 65.08% 및 53.99%로 가장 높게 나타났다. α-Glucosidase는 소장 상피세 포의 brush-border membrane에 존재하는 효소로서 이당류나 다당류를 탄수화물이 소화 흡수되기 위한 상태인 단당류로 가수분해하는 역할을 하며, α-glucosidase에 대한 저해능은 탄 수화물 식이 후 혈당상승을 억제할 수 있어 항당뇨 활성 측 정법으로 이용된다(Gua 등 2006). 땅콩 종피의 항당뇨 활성 에 대한 연구는 α-glucosidase 및 α-maylase 저해활성(Tsukita 등 2013)과 함께 Caco2 소장세포로의 포도당 유입 저해 활성 에 대한 연구가 보고되었으며(Tamura 등 2015), 땅콩 및 땅콩 종피 추출물의 항당뇨 효능 평가에 대한 De Camargo 등(2017a)의 연구에서는 땅콩종피(peanut skin), 땅콩종자(whole peanuts), 건조땅콩종자(dry-blanched peanut) 순으로 높은 α-glucosidase 저해활성을 나타낸다고 하여 땅콩 종피 추출물의 항당뇨 활 성에 대해 확인하였다.

    2. Tyrosinase 저해활성

    추출용매에 따른 품종별 땅콩 종피 추출물의 tyrosinase 저 해활성을 측정한 결과는 Fig. 2와 같다. 양성대조군으로 사용 한 kojic acid는 0.05 mg/mL의 농도에서 50.69%의 tyrosinase 저해활성을 나타내었다. 품종별 땅콩 종피 추출물의 tyrosinase 저해활성은 케이올, 신팔광, 다안 및 흑생 품종이 추출물 2 mg/ mL 의 농도에서 각각 20.54~68.71%, 29.56~76.45%, 37.55~82.49% 및 40.73~80.95%로 나타나 다안과 흑생 품종이 다른 품종에 비해 유의적으로 높은 tyrosinase 저해활성을 보였다. 추출용 매에 따른 땅콩종피 추출물의 tyrosinase 저해활성은 품종에 상관없이 80% 메탄올 및 80% 아세톤 추출물이 각각 67.36~ 82.49% 및 68.71~8.49% 범위로 80% 에탄올 및 물 추출물에 비해 높게 나타났다. Melanin은 피부 흑화 및 기미, 주근깨 같은 피부질환의 원인이 되는데, tyrosinase는 melanin 합성의 key enzyme으로 melanin 합성의 초기단계인 L-tyrosine 에서 L-DOPA로 전환시키는 hydroxylase로서의 활성과 L- DOPA 에서 L-dopaquinone으로 전환시키는 dopaoxidase로서의 활성 을 모두 가지고 있다 (Imokawa & Mishima 1980). 따라서 melanin 생합성 과정에서 중요한 역할을 하는 tyrosinase를 억 제하게 되면 피부의 melanin 색소 생성을 조절하여 미백효능 을 나타내는 물질로 사용할 수 있어 tyrosinase 억제제에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다(Laskin & Piccinini 1986). 땅콩 종피 추출물의 tyrosinase 저해활성에 대한 연구는 보고된 바 없지만, 포도씨(Bai 등 2019), 녹두종피(Cahi 등 2018) 및 수수 (Wang 등 2011)와 같은 식물로부터 추출한 procyanidin dimer, trimer 및 tetramer와 같은 카테킨 중합체와 delphinidin-3- glucoside(D3G), cyanidin-3-glucoside(C3G) 및 petunidin-3-glucoside (Pt3G)와 같은 안토시아닌 계열의 색소가 UV에 의한 지질 과 산화 억제 능력이 있고, 멜라닌 생성에 관여하는 tyrosinase 활성 저해가 있다고 보고한 바 있다. 따라서 본 연구에서 적 색땅콩 품종 중 다안이 tyrosinase 저해활성이 높게 나타난 것 은 주요 색소성분인 procyanidin oligomer 함량이 신팔광 및 케이올보다 높은 것에 기인된 것으로 생각되며, 안토시아닌 과 procyanidin oligomer은 메탄올과 아세톤에 효과적으로 추 출되는 것으로 판단된다.

    3. Angiotensin converting enzyme I (ACE) 저해활성

    추출용매에 따른 품종별 땅콩종피 추출물의 ACE 저해활 성을 측정한 결과는 Fig. 3과 같다. 양성대조군으로 사용한 enalapril maleate는 0.025 mg/mL의 농도에서 49.27%의 ACE 저해활성을 나타내었다. 품종에 따른 땅콩 종피 추출물의 ACE 저해활성은 다안 품종이 추출물 10 mg/mL의 농도에서 31.37~73.64%로 가장 우수한 저해활성을 보였으며, 흑생 및 신팔광 품종은 각각 36.09~62.23% 및 23.16~60.89% 범위로 나타났고, 케이올의 경우 13.68~42.92% 범위로 모든 추출물 에서 가장 낮은 저해능을 보였다. 하지만, 물추출물의 경우 특이적으로 다안(31.37%)보다 흑생(36.09%) 품종이 높은 ACE 저해활성을 보여 물 추출 시 적색땅콩보다 흑색땅콩의 항고 혈압 활성이 높게 나타났다. 추출용매에 따른 품종별 땅콩 종피추출물의 ACE 저해활성을 살펴보면, 모든 품종에서 80% 메탄올(42.92~73.64%), 에탄올(31.26~53.59%), 아세톤(23.82~ 46.41%) 및 물 추출물(13.68~36.09%) 순서로 높게 나타났다. 즉, 종합적으로 다안 품종의 땅콩 종피를 80% 메탄올로 추출 하였을 때 ACE 저해활성이 10 mg/mL의 농도에서 73.64% 가장 높게 측정되었다. ACE는 불활성형의 angiotensin I(decapeptide) 의 C말단에 존재하는 His-Leu를 절단하여 혈관벽 수축작용 을 하는 angiotensin Ⅱ(octapeptide)를 생성하고, 혈압을 감소 시키는 bradykinin을 불활성화 시키는 효소이다(Noh & Song, 2001). ACE 저해제는 ACE의 작용을 저해함으로써 angiotensin Ⅱ의 생성저해, aldoterone 분비 감소, 혈관확장제인 bradykinin 의 증가 등의 과정을 통해 신장혈관을 확장시켜 sodium의 배 설을 촉진함으로써 혈압을 낮추어 줄 수 있다. 땅콩 종피 추 출물의 ACE 저해 활성에 대한 연구는 보고되지 않았지만, 적포도 껍질 및 포도씨로부터 추출한 proanthocyanidins(PAs) 중합체의 ACE 저해활성은 IC50값이 0.019~24.63 μM로 우수 하게 나타났고, 그 활성은 구조적 특징에 따라 상이하게 나 타나 epicatechin 및 galloylation 비율에 따라 다양한 ACE 저 해활성을 보인다고 보고하였다(Godoy 등 2012). 따라서, 본 연구에서 다안 품종의 종피에 proanthocyanidins 함량이 높아 항고혈압 활성이 높게 나타난 것으로 생각되며, ACE 저해 활성이 높은 proanthocyanidins은 메탄올로 추출하였을 때 효 과적으로 용출되는 것으로 판단된다.

    4. 폐암 (NCI-H460) 성장억제효과

    품종 및 추출용매에 따른 땅콩종피 추출물의 인체유래 폐 암세포주(NCI-H460) 성장억제효과에 대한 결과는 Fig. 4와 같다. 암세포주의 성장억제 효과 평가전 3T3-L1세포에서 땅 콩종피 추출물의 세포독성을 확인 하였으며(Table 1), 90% 이상의 생존율을 보이는 200 μg/mL 이하의 농도에서 항암활 성을 측정하였다. 50 μg/mL 농도에서는 모든 추출물에서 80% 이상의 세포생존율을 보여 성장억제효과를 나타내지 않았지만 100 및 200 μg/mL 농도에서는 각각 57.89~73.69 % 및 41.03~73.69 %의 세포생존율을 보여 품종 및 추출용매에 따라 다양한 항암 활성을 보였다. 품종별 땅콩 종피 추출물은 200 μg/mL 농도에서 다안(41.03~52.42%), 신팔광(44.08~57.50%), 케이올(46.63~ 59.87%) 및 흑생(55.91~73.69%) 품종 순으로 폐 암세포주의 성장을 억제하였다. 또한, 추출용매에 따른 땅콩 종피 추출물의 폐암세포주에 대한 세포생존율은 메탄올 추출물 이 200 μg/mL의 농도에서 41.03~60.45%로 가장 우수한 억제 효과를 보였으며, 아세톤추출물과 에탄올 추출물이 각각 44.93~ 55.91% 및 46.49~63.31% 범위로 나타났고, 물추출물 의 경우 52.42~ 73.68%로 가장 낮은 억제효과를 나타냈다. 즉, 적색땅콩인 다안 품종을 80% 메탄올로 추출하였을 때, 인체유래 폐암세포주(NCI-H460)에 대한 세포생존율이 50, 100 및 200 μg/mL의 농도에서 각각 81.41, 57.89 및 41.03% 로 농도 의존적으로 감소하여 가장 우수한 항암활성을 보였다. 땅콩 및 땅콩종피 추출물은 유방암, 자궁경부암(Saenglee 등 2016) 및 전립선암(Cehn 등 2018)에 대한 항암활성이 보고되었으 며, 땅콩종피로부터 분리한 procyanidin의 전립선암세포주 (DU145) 성장 억제 효과에 관한 Chen 등(2018)의 연구에서 procyanidin B3와 procyanidin dimer가 12.5~100 μg/mL의 농도 에서 유의적인 증식억제 효과를 보였으며, apotosis 과정에 관련된 ROS 축적과 p53 및 caspases-3의 활성화를 조절함으 로써 적색 땅콩의 주요 성분인 procyanidin 중합체가 우수한 항암활성을 나타낸다고 보고하였다. 땅콩종피 추출물의 폐 암세포주에 미치는 영향에 대한 연구는 보고된바 없지만, 식 물로부터 추출한 procyanidin은 폐암세포(A-427) 및 폐선암종 세포의 형태학적 변화 및 apoptosis를 유발한다는 연구(Ye 등 1999) 결과로 미루어 볼 때, 본 연구에서 폐암세포주의 증 식억제 효과는 다안을 비롯한 적색 땅콩에 다량 함유되어 있 는 procyanidin 중합체가 폐암세포주의 형태학적 변화와 apotosis를 유발함에 따른 결과로 판단된다.

    5. 대장암세포(HCT-116) 성장억제효과

    품종 및 추출용매가 땅콩 종피 추출물의 인체유래 대장암 세포주(HCT-116) 성장억제에 미치는 영향을 살펴본 결과, Fig. 5와 같이 처리농도에 따라 다양하게 나타났다. 저 농도인 50 및 100 μg/mL의 경우, 모든 추출물에서 각각 89.39~ 105.80% 및 78.76~96.27%의 세포 생존율을 보여 폐암 및 유 방암 세포주에 비해 성장억제 효과가 미비하였지만, 200 μg/mL 에서는 세포생존율이 품종 및 추출용매에 따라 89.55∼48.13% 범위까지 감소하였다. 200 μg/mL 농도에서 대장암 세포 성장 억제효과를 품종별로 살펴보면 케이올, 신팔광, 다안 및 흑 생 품종이 각각 64.27~76.16%, 60.18~71.92%, 48.13~62.86 및 65.98~89.55%로 모든 추출용매에서 다안 품종이 가장 우수 한 항암활성을 나타내었다. 또한, 추출용매에 따른 땅콩종피 추출물의 대장암세포(HCT-11)에 대한 성장억제효과는 적색 땅콩인 신팔광, 케이올 및 다안 품종은 메탄올 추출물이 48.13~64.28%으로 가장 효과적으로 세포생존율을 저해하였 지만, 흑색땅콩인 흑생 품종은 아세톤 추출물이 65.98%로 가 장 우수한 항암활성을 나타냈다. 즉, 다안 품종의 땅콩 종피 를 80% 메탄올로 추출하였을 때, 50, 100 및 200 μg/mL의 농 도에서 대장암세포주의 세포생존율을 89.39, 78.46 및 48.13% 로 농도 의존적으로 감소시켜 가장 효과적으로 대장암세포 주의 성장을 억제하였다. 적색 땅콩의 주요 기능성분인 프로 안토시안딘의 항암활성은 구강암세포(KB, CAL-27), 유방암 세포(MCF-7), 대장암세포(HT-29, HCT116), 전립선암세포 (LNCap) 등 다양한 인체유래 암세포의 증식억제 및 apotosis 를 유발한다는 연구가 다수 진행되었다(Seeram 등 2006). 특 히, Choy 등(2016)의 연구에 따르면, epicatechine subunit이 2~6 개 결합되어 있는 procynidin oligomer 추출물이 인체유래의 다양한 대장암세포(Caco-2, HCT 116, SW-480, HT-29, Lovo 및 HCT-15)의 P13K/Akt 신호경로를 억제함으로써 암세포주 의 형태학적 변화와 apotosis를 유발하고, 증식을 억제한다고 보고하여(Choy 등 2016), 본 연구에서도 다안, 케이올, 신팔광 등의 적색 땅콩의 종피 추출물에 함유되어 있는 procyanidin 과 같은 폴리페놀화합물이 검은 땅콩의 안토시아닌보다 인 체유래 대장암 세포(HCT-116)의 성장을 효과적으로 억제한 것으로 판단된다.

    6. 유방암세포(MCF-7) 성장억제효과

    품종 및 추출용매에 따른 땅콩종피 추출물이 인체유래 유 방암세포(MCF-7) 성장 억제에 미치는 영향을 측정한 결과는 Fig. 6과 같다. 모든 처리구의 50 μg/mL 농도에서 80% 이상의 세포생존율을 보인 폐암세포(NCI-H460) 및 대장암세포(HCT- 116)와 달리 유방암세포(MCF-7)는 땅콩종피 추출물을 50 μg/mL, 100 μg/mL 및 200 μg/mL에서 각각 57.73~87.26%, 47.78~7.22% 및 36.02~61.63%의 세포생존율을 보여 저농도에서도 항암활 성을 나타냈다(Fig. 7). 품종별 땅콩 종피 추출물의 유방암 세 포 성장억제효과를 살펴보면, 추출물 200 μg/mL의 농도에서 처리하였을 때 적색품종은 다안(36.02~42.20%), 신팔광(39.80~ 47.17%) 및 케이올(47.00~54.70%) 순서로 유방암세포주를 효 과적으로 억제하였으며, 흑색품종인 흑생은 38.55~61.63%의 세포생존율을 보여 용매에 따른 차이가 크게 나타났다. 또 한, 추출용매에 따른 품종별 종피추출물의 유방암세포 성장 억제 효과는 흑생품종을 제외한 케이올, 신팔광 및 다안은 품종에 상관없이 메탄올 추출물 200 μg/mL의 농도에서 각각 40.71, 39.80 및 36.02%로 세포생존율을 가장 효과적으로 감 소시켰지만, 흑생품종은 아세톤(38.55%), 메탄올(49.19%), 에 탄올(57.96%) 및 물추출물(61.63%) 순으로 높은 항암활성을 나타내었다. 즉, 다안 품종의 메탄올 추출물과 흑생 품종의 아세톤 추출물을 유방암 세포주에 처리하였을 때 각각 36.02 및 38.55%의 세포생존율을 보여 가장 효과적으로 성장을 억 제하는 것을 확인하였다. 땅콩 유래 페놀화합물의 유방암 및 자궁경부암의 항암활성에 대한 Saenglee 등(2016)에 대한 연 구에서는 p-coumaric acid, ferulic acid 및 resveratrol과 같은 monomeric phenolics가 인체유래의 유방암세포(MCF-7) 및 자 궁경부암세포(HeLa)의 Cell cylcle과 apotosis 과 관련된 Bcl-2, p53, p21, CDK4 및 pERK1/2과 같은 단백질 발현을 조절함으 로써 세포의 성장을 억제한다고 하였으며(Saenglee 등 2016), 적색 땅콩 종피의 주요 성분 중에 하나인 procyanidin dimer는 10∼50 mM에서 MCF-7 유방암 세포주의 apotosis와 성장을 효과적으로 억제한다고 하였다(Aelar & Couvea 2012). 따라서 본 연구에서 땅콩종피 메탄올 추출물의 유방암세포(MCF-7) 에 대한 항암활성은 다른 세포주와 마찬가지로 항암활성을 나타내는 monomeric phenolics와 procyanidin dimer 등의 폴리페 놀성 화합물이 메탄올로 추출하였을 때 효과적으로 용출되 는 것으로 판단되며, 향후 이러한 항암 성분과 메커니즘 구 명에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

    7. 상관관계분석

    품종 및 추출용매에 따른 땅콩 종피 추출물의 α-glucosidasse, tyrosinase 및 ACE 저해활성과 인체유래 폐암세포(NCI-H460), 대장암(HCT-116) 및 유방암세포(MCF-7)에 대한 세포생존율 간의 상관관계를 분석한 결과는 Table 2와 같다. α-Glucosidase 저해활성은 tyrosinase 저해활성(r=0.680**), ACE 저해활성 (r=0.640**)과는 높은 양의 상관관계를 나타내었으며, 암세포 주의 세포생존율과 폐암세포(r=-0.755**), 대장암세포(r=-0.452**) 및 유방암세포(-0.389**) 모두 높은 음의 상관관계를 보였다. 또한, ACE 저해활성의 경우 암세포주의 세포생존율과의 상 관분석 결과, 폐암세포, 대장암세포 및 유방암세포가 각각 -0.397**, -0.354* 및 -0.228로 음의 상관성이 α-glucosidase 및 tyrosinase에 비해 상대적으로 낮게 나타났지만, 전체적으로 추출물에 대한 효소저해활성과 암세포주의 생존율은 음의 상관관계를 보여 효소저해활성이 높은 추출물은 암세포주의 세포생존을이 낮아 효과적인 암세포주 증식 억제효과를 확 인하였다.

    요약 및 결론

    본 연구에서는 땅콩 종피 추출물의 생리활성을 검토하기 위하여 품종별 땅콩 종피의 추출용매에 따른 in vitro 효소저 해활성 및 인체유래 암세포주 증식 억제효과를 측정하였다. 품종은 케이올(Arachis hypogaea L. cv. K-OL), 신팔광(cv. Sinpalkwang), 다안(cv. Daan)과 흑생(cv. Heuksaeng) 품종을 사용하였고, 땅콩 종피를 80% 에탄올(v/v), 80% 메탄올(v/v), 80% 아세톤(v/v) 및 증류수(v/v)로 초음파 추출한 후, tyrosinase 저해활성, ACE 저해활성, α-glucosidase 저해활성과 함께 인 체유래 폐암세포(NCI-H460), 대장암(HCT-116) 및 유방암세 포(MCF-7)에 대한 성장억제 효과에 대해 측정하였다. 미백, 고혈압 및 통풍에 관여하는 α-glucosidase, tyrosinase 및 ACE 효소 저해활성은 다안 품종의 땅콩 종피를 80% 메탄올로 추 출하였을 때, 각각 65.08%(0.025 mg/mL), 82.49%(2 mg/mL) 및 73.61%(10 mg/mL)로 가장 효과적으로 저해하는 것을 확 인하였으며, tyrosinase 저해활성의 경우, 흑색 땅콩의 흑생 품종이 다안과 유사한 범위의 활성을 나타내었다. 또한, 품종 및 추출용매에 따른 땅콩 종피의 인체유래 대장암(HCT-116), 폐암(NCI-H460) 및 유방암(MCF-7) 세포주에 대한 증식억제 효과 측정 결과, 다안>신팔광>케이올>흑생 순으로 우수한 암세포 성장억제효과가 나타났다. 특히, 유방암세포(MCF-7) 은 저농도(50 μg/mL)에서도 57.73~87.26% 범위의 세포생존 율을 보여 가장 높은 암세포 증식억제 효과를 나타내었으며, 다안 품종의 메탄올 추출물을 유방암 세포주에 처리하였을 때 각각 36.02%의 세포생존율을 보여 가장 효과적으로 성장 을 억제하는 것을 확인하였다. 따라서, 품종 및 추출용매에 따라 다양한 효소저해활성 및 암세포주 증식 억제 활성에 차 이가 나며, 이는 적색 및 흑색 땅콩에 함유되어 있는 프로시 아니딘 중합체, 플라보노이드 및 안토시아닌 등의 페놀화합 물의 차이와 함께 추출용매의 극성에 따라 추출된 페놀화합 물의 용해도 차이로 생각된다. 이상의 결과로부터 땅콩종피 의 품종 및 추출용매에 따른 생리활성을 확인하였으며, 국산 땅콩 부산물로부터 다양한 생리활성을 나타내는 색소 추출 물의 개발이 가능할 것으로 생각된다. 또한, 추후 땅콩 종피 로부터 미백, 항고혈압, 항당뇨 및 항암 활성 물질의 분리 동 정과 메커니즘 규명에 대한 연구가 수행되어야 할 것으로 판 단된다.

    감사의 글

    본 논문은 농촌진흥청 연구사업(세부과제명: 국내 육성땅 콩의 생리활성 검정, 세부과제번호: PJ01430303)의 지원에 의 해 이루어진 것입니다.

    Figure

    KSFAN-32-5-511_F1.gif
    α-Glucosidase inhibitory activity (%) peanut skin (0.025 mg/mL) depending on cultivars and extraction solvent.

    Value are mean±SD of 4 replicates. Different capital letters in the same items indicate a significant difference (p<0.05) among different cultivars. Different small letters in the same items indicate a significant difference (p<0.05) among different extraction solvent.

    KSFAN-32-5-511_F2.gif
    Tyrosinase inhibitory activity (%) of peanut skin extracts (2 mg/mL) depending on cultivars and extraction solvent.

    Value are mean±SD of 4 replicates. Different capital letters in the same items indicate a significant difference (p<0.05) among different cultivars. Different small letters in the same items indicate a significant difference (p<0.05) among different extraction solvent.

    KSFAN-32-5-511_F3.gif
    ACE inhibitory activity (%) of peanut skin (10 mg/mL) depending on cultivars and extraction solvent.

    Value are mean±SD of 4 replicates. Different capital letters in the same items indicate a significant difference (p<0.05) among different cultivars. Different small letters in the same items indicate a significant difference (p<0.05) among different extraction solvent.

    KSFAN-32-5-511_F4.gif
    Anti-proliferative effects of peanut skin extracts depending on cultivars and extration solvent in NCI-H460 lung cancer cell.

    Value are mean±SD of 4 replicates. Different capital letters in the same items indicate a significant difference (p<0.05) among different cultivars and extraction solvent. Different small letters in the same items indicate a significant difference (p<0.05) among different treatment concentration. *EE: ethanol extracts, ME: methanol extracts, AE: acetone extracts, WE: water extracts.

    KSFAN-32-5-511_F5.gif
    Anti-proliferative effects of peanut skin extracts depending on cultivars and extration solvent in HCT 116 colon cancer cell.

    Value are mean±SD of 4 replicates. Different capital letters in the same items indicate a significant difference (p<0.05) among different cultivars and extraction solvent. Different small letters in the same items indicate a significant difference (p<0.05) among different treatment concentration. *EE: ethanol extracts, ME: methanol extracts, AE: acetone extracts, WE: water extracts.

    KSFAN-32-5-511_F6.gif
    Anti-proliferative effects of peanut skin extracts depending on cultivars and extration solvent in MCF-7 breast cancer cell.

    Value are mean±SD of 4 replicates. Different capital letters in the same items indicate a significant difference (p<0.05) among different cultivars and extraction solvent. Different small letters in the same items indicate a significant difference (p<0.05) among different treatment concentration. *EE: ethanol extracts, ME: methanol extracts, AE: acetone extracts, WE: water extracts

    KSFAN-32-5-511_F7.gif
    Anti-proliferative effects of peanut skin methanol extracts (200 μg/mL) depending on cultivars in human colon cancer cell (HCT-116), Human lung cancer cell (NCI-H460) and human breast cancer cell (MCF-7).

    Value are mean±SD of 4 replicates. Different small letters in the same items indicate a significant difference (p<0.05) among different cultivars.

    Table

    Cell viability for Non-cancer cell (3T3-L1 adipocyte cell) of peanut skin extraction depending on cultivars and extraction solvent.
    Correlation coefficients among inhibitory effect of α-glucosidase, tyrosinase, ACE activity and cell viability of human lung cancer cell(NCI-H460), colon cancer cel(HCT-116), breast cancer cell(MCF-7) of peanut skin extracts depending on cultivars and extraction solvent

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