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ISSN : 1225-4339(Print)
ISSN : 2287-4992(Online)
The Korean Journal of Food And Nutrition Vol.32 No.3 pp.208-215
DOI : https://doi.org/10.9799/ksfan.2019.32.3.208

Proximate Analysis, Fatty Acid Composition of Lycopus lucidus Turcz. and Its Cytotoxic Effect in Cancer Cell Lines

Eun Na, Jung-Woo Lee*, Sun-Young Lim**
Graduate Student, Ocean Science and Technology School, Korea Maritime & Ocean University, Busan 49112, Korea
*Graduate Student, Division of Marine Bioscience, Korea Maritime & Ocean University, Busan 49112, Korea
**Professor, Division of Marine Bioscience, Korea Maritime & Ocean University, Busan 49112, Korea
Corresponding author: Sun-Young Lim, Professor, Division of Marine Bioscience, Korea Maritime & Ocean University, Busan 49112, Korea. Tel: +82-52-410-4757, Fax: +82-51-404-4750, E-mail: sylim@kmou.ac.kr
04/04/2019 22/05/2019 14/05/2019

Abstract


In this paper, we investigate to determine quality characteristics, fatty acid composition and cytotoxic effect of extracts and fractions from whole Lycopus lucidus Turcz. roots. Additionally, we evaluated cytotoxic activity against the growth of human fibrosarcoma cells (HT-1080) and human gastric adenocarcinoma (AGS), human colon cancer cell (HT-29) lines using a 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay. Acetone+methylene chloride (A+M) and methanol (MeOH) extracts from L. lucidus Turcz. were obtained through solvent extraction. Then we further fractionated both extracts with n-hexane, 85% aq. MeOH, n-butanol (n-BuOH) and water. In fatty acid composition, L. lucidus Turcz. contained 33.2% of 18:1n-9 and 1.81% of 18:3n-3, respectively. The incorporation of treatment with A+M and MeOH extracts and n-hexane, 85% aq. MeOH, n-butanol (n-BuOH) and water fractions dose-dependently increased cytotoxicity against the growth of HT-1080 and AGS, HT-29 cancer cells (p<0.05). The A+M extract had a higher inhibitory effect on the growth of all cancer cells in comparison to MeOH extract. Among the fractions, the 85% aq. MeOH and n-hexane fractions showed a higher inhibitory effect after proliferating the three cancer cells. These results suggest that the 85% aq. MeOH and n-hexane fractions have a potential to inhibit the growth of human cancer cell lines.



택란의 일반성분, 지방산 조성 및 세포독성 효과

나 은, 이 정우*, 임 선영**
한국해양대학교 해양과학기술전문대학원 대학원생
*한국해양대학교 해양생명과학부 대학원생
**한국해양대학교 해양생명과학부 교수

초록


    서 론

    눈부신 과학기술과 의학의 발전에도 불구하고, 비만, 당뇨 병, 고혈압, 동맥경화 등 대사성 질환 및 각종 암 발병률은 높은 편이다. 암은 인종, 국가, 성별, 나이, 식이 및 생활습관 등에 따라 다양한 장기에 발생할 수 있는데, 우리나라에서 가 장 많이 발생한 암은 갑상선암, 위암, 결장암, 폐암, 유방암, 간암, 전립선암, 췌장암, 담낭암 등이 있다. 특히 식이습관은 개개인들의 선택과 노력으로 건강하게 개선할 수 있으므로 이에 현대인들은 건강 기능성 식품 소재에 대한 관심 및 요구 가 증가하는 추세이다(Ryu BH 1991).

    택란(Lycopus lucidus Turcz.)은 꿀풀과(Labiatae) 쉽싸리속 (Lycopus)에 속하는 여러해살이 초본으로 중국과 한국에서 재 배되며, 주로 샐러드 형태로 섭취 이용되고 있다. 우리나라에서 자라는 택란의 종류에는 개쉽사리(L. coreanus Léveillé), 좀개 쉽사리(L. coreanus var. piperascens Nakai), 쉽사리(L. iucidus Turcz), 애기쉽사리(L. maackianus Makino), 흑쉽사리(L. uniflorus Michaux) 등이 있다(Kim 등 1997). 택란의 생리활성에 관한 연구로는 항산화 효과(Lu 등 2015;Song 등 2016;Yang MO 2017) 및 항염증(Lee 등 2008) 효과가 보고되어 있다. Yang 등 (2010)은 택란 뿌리로부터 α-galacto-oligosaccharides(GOS)를 분리하였고, 이는 면역증강 활성이 있다고 보고하였다. 택 란의 인체 암세포 증식 억제효과에 관한 연구들 중 Kim & Ghil(2009)은 유방암 세포 MCF-7의 apoptosis 유도과정을 택 란 메탄올 추출물이 저해하여 유방세포의 증식을 억제한다고 보고하였다. 특히 apoptosis의 지표인 Bcl-2 및 caspase-7의 발 현을 감소시켰으며, 세포주기와 관련된 단백질들(cdk4, cyclin D1 및 E2F-1)의 생성을 감소시켰다고 보고하였다. Xiong 등 (2012)은 택란 유래 다당류 처리는 인체 간암 세포(BEL-7402) 의 증식을 억제하였다고 보고하였다. Kim 등(2018)은 택란 에 탄올 추출물이 마우스 결장암 세포(CT-26)에서 matrix metalloprotease( MMP)-9와 Runx-2의 활성을 감소시켜 결과적으로 전이 과정을 저해하였다고 보고하였다. 이에 본 연구에서는 선행된 연구를 토대로 한국인들에게 흔하게 발병하는 인체 위암과 결장암 세포를 중심으로 택란 추출물과 분획물의 in vitro 항암활성 가능성을 규명하고, 택란의 일반성분 및 지방 산 조성을 분석하여 건강기능 식품 또는 약선 재료로 활용하 기 위한 기초자료를 제시하고자 한다.

    재료 및 방법

    1. 재료

    미산약초농장(경상북도 대구광역시)으로부터 본 실험에 사용된 택란 뿌리를 제공받아 사용하였다.

    2. 추출 및 분획

    택란은 동결건조기(Ilshin Biobase, Dongducheon, Korea) 를 이용하여 건조한 후 건뿌리(200 g)를 마쇄하여 실온에서 acetone과 methylene chloride를 1:1 비율로 혼합하여 24시간 방치한 후 추출하여 얻은 추출액은 40℃ 수욕 상에서 rotary evaporator(N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 농축하여 acetone/ methylene chloride 추출물(A+M, 0.6 g)을 얻었다. A+M 용매 로 추출되지 않은 성분을 추출하기 위해 남은 잔사에 동량의 methanol을 부어 2회 반복하여 추출한 후 농축하여 methanol 추출물(MeOH, 7.2 g)을 얻었다. 생리활성을 최대한 분리하기 위하여 위의 A+M 및 MeOH 두 액상 추출물들을 합하여 먼저 n-hexane과 85% aq. MeOH 용액을 분획깔때기에 부어 분획 하여 각각 n-hexane 분획물(0.85 g) 및 85% aq. MeOH 분획물 (0.56 g)을 얻었다. 남은 액상 잔사에 n-butanol(n-BuOH)과 water 를 부어 분획한 후 각각 n-butanol(n-BuOH) 분획물(0.37 g) 및 water 분획물(4.92 g)을 얻었다. 세포 실험에는 각 추출물과 분획물을 dimethyl sulfoxide(DMSO)에 녹여 배지로 필요한 농 도로 희석하여 사용하였다.

    3. 일반성분 분석

    수분, 조단백질, 조지방, 조회분은 AOAC 방법(1996)에 따 라 분석하였다. 즉, 수분은 상압가열건조법(105℃ 건조법), 조 단백질은 Kjeldahl 질소정량법, 조지방은 Soxhlet 추출법, 조 회분은 550℃ 전기로에서 화학시키는 직접회화법으로 정량 하였다. 식이섬유소는 산 가수분해법을 이용하였고, 시료에 잔존하는 조회분과 조단백질을 측정한 값을 차감하여 식이 섬유 함량을 분석하였다(Na 등 2018).

    4. 지질 및 지방산 추출

    Folch 등(1957)의 방법을 변형하여 지질을 추출하였다. 즉, 건조 택란은 methanol [butyl hydroxy toluene(BHT) 함유]로 교 반하여 균질화하였다. 균질물(1 mL)에 chloroform 2 mL와 0.2 M NaH2PO4 1.4 mL를 넣고 mix하여 4℃에서 3,000 rpm으로 3분간 원심분리 후 지질층을 분리하였다. Morrison & Smith (1964)의 방법에 따라 추출된 지질을 boron trifluoride(BF3) methanol 1 mL 및 n-hexane 0.4 mL와 함께 100℃에서 1시간 동안 가열하였다. 실온까지 냉각시킨 다음 n-hexane 2 mL와 증류수 2 mL를 넣고 4℃에서 3,000 rpm으로 3분간 원심분리 후 상등액을 취했다. 이 상등액을 N2 가스로 유기용매를 날린 후 지방산을 얻었고, 지방산 분석 전까지 -75℃ deep freezer (NF-400SF, NIHON FREEZER, Tokyo, Japan)에 보관하였다.

    5. Gas chromatography를 이용한 지방산 분석

    Gas chromatography(GC)를 이용하여 지방산 조성을 분석 하였다. 이때 사용된 column은 silica capillary column(CP-7856, 60 m × 0.32 mm inner diameter × 0.10 μm film thickness)이고 GC 기기의 분석조건은 다음과 같다: Injector 온도 250℃, detector( FID) 온도 250℃, oven 온도는 초기에는 130℃로 설정한 후 분당 증가시켜 175℃까지 4℃/min, 210℃까지 1℃/min, 245℃까지 30℃/min로 셋팅하고, 사용된 carrier gas는 헬륨이 었다. 표준용액의 retention time과 비교하여 지방산을 정성하 였고, 내부표준물질(22:3n-3, methyl ester)을 이용하여 총 지 방산을 정량하였으며, 개개의 지방산들은 전체 피크 면적의 퍼센트로 산출하였다(Salem 등 1996).

    6. MTT assay

    배양된 인체 암세포들(HT-1080 섬유육종, AGS 위암, HT-29 결장암)은 96 well cell culture plate에 5×104 cell/mL가 되도록 100 μL씩 분주하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양 한 후 배지를 제거한 뒤 각 시료를 배지로 희석하여 각 well 당 100 μL씩 첨가하고, 대조군에는 시료 대신 PBS를 첨가하 였다. 이 plate를 37℃, 5% CO2 incubator에서 48시간 배양하였 고, MTT assay(Denizot & Lang 1986)를 위하여 3-(4,5-dimethylthiazole)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 시약 5 mg을 PBS 1 mL로 녹인 후, 10% FBS가 함유된 배지 9 mL와 희석 하여 100 μL를 첨가하고 3~4시간 동안 더 배양하여 MTT가 환원되도록 하였다. 배지가 제거된 각 well에 formazan 결정 을 용해시키기 위하여 DMSO를 100 μL씩 분주하여 5~10분간 반응시켜 microplate reader(VICTOR3, Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)로 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

    7. 통계분석

    실험결과는 Mean±SEM(Standard Error of Mean)으로 나 타내었고, 실험결과는 대조군과 각 시료로부터 얻은 실험 자 료로부터 one-way ANOVA를 실시하여 유의성을 검증하였으 며, Tukey’s test를 실시하여 사후 검증하였다.

    결과 및 고찰

    1. 택란 일반성분 및 지방산 조성

    택란의 수분함량은 75.6%로 나타났고, 조탄수화물, 조단백 질 및 조지방은 각각 10.6%, 5% 및 0.3%이며, 조회분과 식이 섬유는 각각 5% 및 3.54%였다. Lee 등(2014)은 건조 초석잠 뿌리 분말의 일반성분 분석한 결과, 조단백질 9.77%, 조회분 5.78% 및 조지방 0.35%로 나타났다고 보고하였다. Lu 등(2015) 은 지리적 및 수확시기별(2013년 11월부터 2014년 1월까지) 택란의 일반성분을 분석한 결과, 조단백질 6.58~14.06%, 조탄 수화물 9.87~46.07% 및 조지방 1.44~4.06% 범위였고, 조단백 질은 수확시기가 늦을수록 증가하였으며, 조탄수화물 함량은 지방함량 증가와 비례하여 감소함을 확인하였고, 환원당 함 량에는 차이가 없었다고 보고하였다. 택란의 지방산 조성은 12.3%의 총 포화지방산(Saturated Fatty Acids: SFA), 57.1%의 총 단일불포화지방산(Monounsaturated Fatty Acids: MUFA), 2.9%의 총 n-6 지방산 및 3.3%의 총 n-3 지방산으로 나타났 다. MUFA 중 특히 16:1n-9 및 18:1n-9 함량은 각각 20.9% 및 33.2%로 높은 함량의 oleic acid를 나타내었고, 1.8%의 18:3n-3 를 함유하였다(Table 1). 최근 초석잠 및 택란의 꾸준한 섭취 는 치매예방에 효과적인 약용식물로 소개되면서 소비가 증 가하는 추세이다(Lee 등 2013). 뇌 기능과 n-3 계열 불포화지 방산 섭취와는 양의 상관관계가 잘 알려져 있으므로(Salem 등 2001) 이에 택란의 지방산 조성을 검사한 결과, 18:1n-9 및 18:3n-3 함량을 확인하였다. Kim 등(2017)은 초석잠 뿌리 분 말의 지방산 조성을 살펴 본 결과, 16:1n-9 및 18:1n-9 함량이 각각 23.0% 및 3.8%로 나타났고, 18:2n-6 및 18:3n-3는 각각 33.7% 및 17.1%로 나타났다고 보고하였다.

    2. 택란 추출물 및 분획물의 세포독성 효과

    택란 추출물 및 분획물의 인체 암세포에 대한 독성 효과를 살펴본 결과는 Fig. 1~6에 나타내었다. 택란 A+M 및 MeOH 추출물을 인체 섬유육종암세포(HT-1080)에 농도별로 처리 했을 때 HT-1080 암세포의 증식을 유의적으로 억제시켰다 (Fig. 1)(p<0.05). A+M 추출물 0.25 및 0.5 mg/mL 첨가농도에 서 각각 70% 및 77% 의 높은 암세포 억제 효과를 나타내었으 며, IC50은 0.07 mg/mL이었다. 택란의 각 분획물들을 농도별 로 HT-1080 암세포에 처리하였을 때, 농도의존적으로 암세 포 억제 효과가 나타났고, 분획물들 중 n-hexane 및 85% aq. MeOH 분획물에 의한 암세포 억제 효과가 가장 높게 나타났 다(Fig. 2). 85% aq. MeOH 분획물은 0.1 mg/mL 이상의 농도 에서 94% 이상의 높은 암세포 억제 효과를 나타내었으며, IC50 은 0.02 mg/mL이었다. n-hexane 분획물의 경우, 0.02 mg/mL의 IC50값을 나타내었다. 인체 위암세포(AGS)의 경우, A+M 추 출물은 0.25 mg/mL의 첨가농도에서 76%의 높은 암세포 억제 효과를 나타내었으며, IC50은 0.06 mg/mL이었다(Fig. 3). MeOH 추출물은(0.5 mg/mL의 첨가농도) 71%의 암세포 억제 효과를 나타내었고, 이때 IC50은 0.31 mg/mL이었다. Fig. 4는 택란 분 획물들의 AGS 암세포 독성에 대한 효과를 나타낸 것으로 HT-1080과 유사하게 n-hexane 및 85% aq. MeOH 분획물에 의 한 암세포 억제 효과가 높았다. 85% aq. MeOH 분획물은 0.1 mg/mL 이상의 농도에서 76% 이상의 높은 암세포 억제 효과 를 나타내었으며, IC50은 0.07 mg/mL이었다. n-Hexane분획물 의 IC50은 0.04 mg/mL이었다. 인체 결장암 세포(HT-29)의 경 우, A+M 추출물은 0.1 mg/mL의 첨가농도에서 82%의 높은 암세포 억제 효과를 나타내었으며, IC50은 0.09 mg/mL이었다 (Fig. 5). MeOH 추출물(0.5 mg/mL의 첨가농도)은 57%의 암 세포 억제 효과를 나타내었고, IC50은 0.40 mg/mL이었다. Fig. 6은 택란 분획물들의 HT-29 암세포 독성에 대한 억제 효과를 나타낸 것으로 HT-1080 및 AGS 세포들과 유사하게 85% aq. MeOH 분획물에 의한 세포독성 활성이 높았다. 85% aq. MeOH 분획물은 0.5 mg/mL 첨가농도에서 67%의 세포독성 효과를 나타내었으며, IC50은 0.33 mg/mL이었다. 이상의 결과로부터 택란에 의한 암세포 억제 효과는 A+M 추출물에서 활성이 높 았고, 분획물들 중에서는 n-hexane과 85% aq. MeOH 분획물 들에서 높음을 나타내었다. 또한 택란 메탄올 추출물이 인 간 폐암 세포인 A549의 DNA 손상을 일으키고, 세포주기를 조절하는 신호전달 체계를 통해 A549 페암세포의 G1 arrest를 유발하여 세포의 성장을 저해하였다고 보고되었다(Park 등 2013). Yu 등(2011)은 택란 유래 essential oil은 6가지 종류의 인체 암세포의 성장을 억제하는 항암 활성을 보였고, 간암 Bel-7402 세포의 세포 사멸을 유도하였다고 보고하였다. Lin 등(2012)은 마우스 혈청과 간 superoxide dismutase과 glutathione peroxidase의 활성이 택란 다당류 식이 첨가에 의해 증 가하였고, 과산화물 함량은 감소되었다고 보고하였다.

    택란의 지방산 조성 분석에서 높은 함량의 18:1n-9과 18:3n-3 함량을 확인하였고, 선행연구(Lee & Lim 2018)에서 택란 A+M 및 MeOH 추출물들은 각각 233 mg/g 및 46 mg/g 함량의 플 라보노이드를 나타냄을 보고하였다. Juan 등(2006)은 높은 함량의 18:1n-9을 함유하는 올리브 추출물은 인체 결장암 세 포(HT-29)에서 apoptosis를 유도하여 암세포 증식을 억제하 였다고 보고하였다. Oleic acid(18:1n-9)는 몇몇 암세포에서 발생, 침윤 및 전이에 중요한 영향을 미치는 oncogene HER2 (erbB-2)의 과도한 발현을 억제하여 암 발생을 감소시킨다고 보고되었다(Carrillo 등 2012). Dai 등(2013)in vitro 실험에 서 18:3n-3 처리는 위암세포(MGC 및 SGC)의 성장을 저해하 였고, 예정세포사(apoptosis)를 유도하였다고 보고하였다. 또 한 인체 결장암세포들(LT97 및 HT-29)에 18:3n-3 처리는 LT97 및 HT-29 세포들의 증식을 억제하였다고 보고되었다(Dommels 등 2002). 아울러 지속적인 플라보노이드 섭취는 AGS 위암 세포의 증식(Theodoratou 등 2007)을 억제시키고, 결장암 위험 을 억제(Choi 등 2012;Kim 등 2014;Xu 등 2016)시킨다고 보 고되었다. 본 연구결과로부터 택란 n-hexane 및 85% aq. MeOH 분획물은 HT-1080, AGS, HT-29 인체 암세포들에서 높은 세포 독성 효과를 보였으며, 이들 분획물들 속에 있는 활성 성분과 관련이 있는 것으로 사료되었고, 본 연구 결과를 기초자료로 하여 향후 택란의 세포독성 효과뿐만 아니라, 다양한 생리활 성 규명이 필요하다고 사료된다.

    요약 및 결론

    택란의 일반성분과 지방산 조성을 분석한 결과, 택란은 75.6% 수분을 함유하였고, 10.6% 조탄수화물, 5% 조단백질, 0.3% 조지방 및 5% 조회분을 함유하였고, 조식이섬유는 3.54% 였다. 택란의 지방산 조성은 12.3%의 총 포화지방산(Saturated Fatty Acids: SFA), 57.1%의 총 단일불포화지방산(Monounsaturated Fatty Acids: MUFA), 2.9%의 총 n-6 지방산 및 3.3% 의 총 n-3 지방산으로 나타났다. 택란의 추출물과 분획물의 인체 섬유종세포(HT-1080), 위암세포(AGS) 및 인체 결장암 세포(HT-29)에 대한 세포독성 효과를 MTT assay를 이용하여 측정하였다. HT-1080, AGS 및 HT-29 암세포에 대한 세포독 성 활성은 택란 A+M 추출물에 의한 억제효과가 MeOH 추 출물에 의한 세포독성 효과보다 높게 나타났다. 택란 분획물 들 중 특히 n-hexane 및 85% aq. MeOH 분획물들은 HT-1080, AGS 및 HT-29 인체 암세포들에 대해 높은 세포독성 효과를 보였으며, 이들 분획물들 속에 있는 활성 성분이 함유되어 있 는 것으로 사료되며, 향후 더욱더 정제하여 규명할 필요가 있다.

    감사의 글

    본 과제(결과물)는 2017년 대한민국 미래창조과학부의 재 원으로 한국연구재단의 지원을 받아 수행된 기초연구사업 (NRF-2017R1A2B4005915)의 연구결과입니다.

    Figure

    KSFAN-32-3-208_F1.gif
    Effect of acetone/methylene chloride (A+M) and methanol (MeOH) extract from L. lucidus Turcz. on the cell viability of HT-1080 human fibrosarcoma cells.

    a~c Different superscripts indicated significant differences at p<0.05.

    KSFAN-32-3-208_F2.gif
    Effect of solvent fractions from L. lucidus Turcz. on the cell viability of HT-1080 human fibrosarcoma cells.

    a~h Different superscripts indicated significant differences at p<0.05. A, n-hexane fraction with n-hexane; B, 85% MeOH fraction with 85% aqueous methanol; C, n-BuOH fraction with n-butanol; D, water fraction with water.

    KSFAN-32-3-208_F3.gif
    Effect of acetone/methylene chloride (A+M) and methanol (MeOH) extracts from L. lucidus Turcz.

    on the cell viability of AGS human gastric adenocarcinoma cells. a~e Different superscripts indicated significant differences at p<0.05.

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    Effect of solvent fractions from L. lucidus Turcz. on the cell viability of AGS human gastric adenocarcinoma cells.

    a~g Different superscripts indicated significant differences at p<0.05. A, n-hexane fraction with n-hexane; B, 85% MeOH fraction with 85% aqueous methanol; C, n-BuOH fraction with n-butanol; D, water fraction with water.

    KSFAN-32-3-208_F5.gif
    Effect of acetone/methylene chloride (A+M) and methanol (MeOH) extracts from L. lucidus Turcz. on the cell viability of HT-29 human colon cancer cells.

    a~d Different superscripts indicated significant differences at p<0.05.

    KSFAN-32-3-208_F6.gif
    Effect of solvent fractions from L. lucidus Turcz. on the cell viability of AGS human gastric adenocarcinoma cells.

    a~g Different superscripts indicated significant differences at p<0.05. A, n-hexane fraction with n-hexane; B, 85% MeOH fraction with 85% aqueous methanol; C, n-BuOH fraction with n-butanol; D, water fraction with water.

    Table

    Several fatty acid compositions (% area) of Lycopus lucidus Turcz

    Reference

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