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ISSN : 1225-4339(Print)
ISSN : 2287-4992(Online)
The Korean Journal of Food And Nutrition Vol.32 No.3 pp.246-250
DOI : https://doi.org/10.9799/ksfan.2019.32.3.246

Effect of Nelumbo nucifera Gaertn Water Extracts on Mouse Spleen and Cytokine Cells Activation

Hye-Sook Ryu
Associate Professor, Dept. of Food and Nutrition, College of Health Sciences, Sangji University, Wonju 26339, Korea
Corresponding author: Hye-Sook Ryu, Associate Professor, Dept. of Food and Nutrition, College of Health Sciences, Sangji University, Wonju 26339, Korea. Tel: +82-33-738-7641, Fax: +82-33-730-0186, E-mail: rhs7420@hanmail.net
07/03/2019 15/05/2019 10/06/2019

Abstract


Nelumbo nucifera Gaertn has been usedas a traditional remedy and food source in South Korea. It promotes gastrointestinal function and controls blood pressures. Nelumbo nucifera Gaertn water extracts supplement at 5, 10, 50, 100, 250, 500, 1,000 μg/mL after a 48 h pre-treatment with the mitogen (ConA or LPS) increased the mouse splenocytes proliferation. Water extract supplement also increased the cytokine production (IL-1β, TNF-α and IFN-γ), measured by a cytokine ELISA kit. For the result of in vitro study, the proliferation of splenocytes and cytokine production activated by peritoneal macrophages increased when water extracts were supplemented in the range of 50~500 μL/mL concentration. Specifically, the levels of the splenocytes proliferation, IL-1β, TNF-α and IFN-γ were the highest at 250 μL/mL concentration. This in vitro study suggestedthat supplementation with Nelumbo nucifera Gaertn water extracts may enhance the immune function by regulating the splenocyte proliferation and enhancing the cytokine production activating macrophage in vitro.



연근 열수추출물 투여가 마우스의 비장세포와 사이토카인의 분비량에 미치는 영향

류 혜숙
상지대학교 보건과학대학 식품영양학과 부교수

초록


    서 론

    연(Nelumbo nucifera)은 한국을 비롯한 중국, 인도, 일본 등 의 지역의 늪이나 연못에서 자라는 다년생 수초로 식용이나 약용으로 널리 이용되고 있다(Yang 등 1985;Kim 등 1996). 연의 뿌리인 연근(Nelumbo nucifera Gaertn)은 식용으로 사용 하여 스트레스, 출혈성 위궤양 등의 약리 효과가 알려져 있다 (Lee 등 2006a;Bae 등 2008). 연근의 생리활성 효과에 관한 연구로는 연근의 혈장 콜레스테롤 감소 효과, 대장암 예방 효 과, 당뇨병 예방 및 항산화, 항암효과 등이 알려져 있다(Jung 등 2003;Ling 등 2005;Lee 등 2006b). 또, 다른 연구에서는 연근의 에탄올 추출물이 고혈압을 강하시키고(Park 등 2005a), 신장보호 효과가 보고되었다(Cho & Kim 2003). 특히 연근의 nuferine 성분은 부정맥을 비롯한 심혈관 질환 예방에 효과가 있는 것으로 알려져 있으며(Qian JQ 2002), Lee 등(2006c)의 연구에서는 알코올로 유발된 흰쥐의 간 손상에 연근 추출물 이 간을 보호하는 연근을 이용한 면역효과에 대한 연구는 미 미한 수준이다. 식품을 소재로 한 면역증진에 관한 연구보고 로는 옥수수와 더덕, 톳, 수수 물 추출물이 마우스의 비장세포 증식과 사이토카인 생성을 촉진시켜 면역세포 활성 효과가 보고된 연구결과가 있다(Ryu & Kim 2004;Park 등 2005b;Ryu 등 2007). 느타리버섯 연구의 50~500 μg/mL에서 높은 면역 활 성효과를 나타난 사례가 있다(Ryu HS 2014). 본 연구는 우리 나라에서 널리 식품 소재로 이용되고 있는 연근을 이용하여 연근 열수 추출물이 마우스 비장세포와 사이토카인에 작용하 여 면역세포를 변화시키는지 확인함으로써 면역 증진효과를 갖는 식품소재로 연근의 활용가능성을 연구하고자 하였다.

    재료 및 방법

    1. 재료 및 시약

    본 실험에 사용된 연근은 건조된 뿌리부분을 경동시장에 서 구입하여 사용하였다. 연근을 증류수로 환류 냉각시키면 서 3회에 걸쳐 반복 추출한 후 감압 농축의 방법으로 연근 열수추출물을 얻어 동결 건조하여 사용하였다. 이 실험에 사 용한 동물은 7~8 주령된 암컷 ICR mouse를 (주)대한실험동 물센터로부터 구입하여 물과 고형 사료를 자유로이 공급하 면서 일주일 정도 적응시킨 후 체중이 15~18 g 내외인 마우 스를 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 실험에 사용하였 다(승인번호 2018-10). 동물실험실 온도는 22~24℃, 습도는 40~60%로 유지하였고, 명암주기(light and dark cycle)는 12시 간 단위로 조절하여 관리하였다.

    2. 마우스 비장세포의 분리 및 배양

    경추 탈골방법으로 처리한 마우스에서 비장을 분리, 적출 하여 RPMI 1640(Sigma, USA) 배양액으로 세척해 멸균 유리 봉으로 분쇄한 후 세포를 유리시켰다. 분리된 세포 현탁액을 200 mesh stainless steel sieve(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)에 통과시킨 다음 3,000 rpm에서 10분간 원심분리 과정 후 적혈구를 제거한 비장세포는 RPMI 1640 medium 용 액에 분산시켜 이용하였다. 세포 수 측정은 trypan blue solution (Sigma, USA)으로 염색한 다음 측정하였다. 세포의 분주는 96-well plate에 90 μL씩 분주하고, 각 군당 mitogen으로 ConA (5 μg/mL), LPS(15 μg/mL)를 10 μL씩 하였다. 대조군은 동량 의 배지를 분주하여 측정하였다. 마우스 비장세포의 증식능 에 이용한 공식은 다음과 같다.

    Proliferation index = Sample 흡광도 Control 흡광도

    3. 사이토카인(IL-1β, IFN-γ, TNF-α) 분비량 측정

    마우스의 복부에서 체취한 대식세포는 세척액을 4℃, 3,000 rpm에서 10분 동안 원심 침전시킨 다음 cell pellet을 얻었다. RPMI 1640 용액으로 3회 원심 세척하여 얻어진 대식세포를 10%의 불활성화된 FBS를 함유한 RPMI 1640 용액에 분산시 킨 후 trypan blue solution으로 염색한 후 hemacytometer를 이용 하여 세포수를 측정하였다. 세포수 농도 희석은 1×106 cell/mL 의 방법으로 하였다. 희석후 24-well plate에 분주한 다음 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 2시간이 지난 후 well의 상층액을 걷어낸 부착 세포(adherent cells)를 이용하여 분석 하였다. 사이토카인(IL-1β, IFN-γ, TNF-α) 분비량의 측정하였 다. 최종농도가 0 μg/mL와 1,000 μg/mL가 되게 하였으며, 부 착성 마우스 복강 대식세포에 10%의 불활성화된 FBS를 함유 한 RPMI 1640 용액을 900 μL 넣고 맞췄다. 연근 열수추출물 을 각 100 μL씩 분주하여 이용하였다. 이때 온도는 37℃, 배 양은 5% CO2 인큐베이터(Sanyo, St. Louis, MO, USA)에서 48 시간 후 배양 후 IL-1β, TNF-α, IFN-γ의 분비량을 ELISA 사 이토카인 kit(R&D system, NY, USA)를 이용하여 분비량을 측 정하였다.

    4. 통계분석

    연구결과의 자료 분석은 통계 프로그램인 SAS package (ver. 12.0)를 이용하였다. 평균값과 표준편차를 구한 후 각 군 간의 차이를 분석하기 위해 일원분산분석(Analysis of Variance: ANOVA)을 사용하였으며, Duncan's multiple range test로 p=0.05 수준에서 사후검정하였다.

    결과 및 고찰

    1. In vitro 실험에서의 연근 열수추출물이 마우스 비장 세포 활성효과

    연근 열수추출물 첨가의 비장세포 활성 효과에 대한 검색 결과는 Table 1과 같다. 연근열수추출물은 0, 5, 10, 50, 100, 250, 500, 1,000 μg/mL의 농도로 배양하였다. 연근 추출물 대 신 배양액(10% FBS-RPMI 1640)을 대조군(negative control)으 로 첨가하여 결과를 확인하였고, 반면, 양의 대조군(positive control)으로는 ConA(5 μg/mL)로 검색하였다. ConA를 첨가 하여 배양한 경우, 연근 열수추출물을 첨가하지 않은 대조군 에 비해 각각 2.67±0.12로 비장세포 분비가 증가되었다. 연근 열수추출물을 첨가하여 배양한 경우 농도 0, 5, 10, 50, 100, 250, 500, 1,000 μg/mL에서 1.00±0.09, 0.84±0.21, 1.10±0.16 1.32±0.19, 1.40±0.20, 1.74±0.14, 1.39±0.24, 0.74±0.20으로 나 타났다. 연구결과에 의하면 음의 대조군(1.00±0.09)에 비해 연근 열수추출물을 첨가한 50 μg/mL와 500 μg/mL의 농도에 서 유의적으로 증가하였다. 1,000 μg/mL와 같은 고농도에서는 감소하는 경향을 보였다. 이는 생강 물 추출물 50~500 μg/mL 에서 유의적인 활성효과를 나타낸 연구 결과(Ryu & Kim 2004) 와 유사하였다. 이와 같이 50~500 μg/mL 농도군에서 연근 열 수추출물이 비장세포 활성을 촉진시켜, 면역 반응을 증가시 킬 가능성이 있는 것으로 보여진다.

    2. 연근 열수추출물이 사이토카인 분비량에 미치는 영향

    IL-1β, IL-2, IL-6과 TNF-α와 같은 cytokine과 nitric oxide 등 이 암세포에 세포독성을 나타낸다는 연구(Kim 등 2004)가 보 고된바 있으며, 특히 초기염증반응에서 IFN-γ, IL-1β, TNF-α 는 세포의 신호전달을 통한 면역작용에 의미 있는 역할을 하 는 것으로 밝혀져 있다(Barnes & Liew 1995;Ryu HS 2010).

    1) IL-1β 분비량

    IL-1β 생성량은 Fig. 1에 나타내었다. 연근 열수추출물을 첨가하지 않은 음의 대조군(3.71±0.54 pg/mL)은 IL-1β를 분비 하였고, 양의 대조군에서 136.47±10.11 pg/mL로 유의적인 분 비량을 보였다(p<0.05). 연근 열수추출물 5, 10, 50 μg/mL 농 도 첨가군에서 각각 15.84±2.79, 19.86±2.99, 25.97±4.53 pg/mL 로 대조군(3.71±0.54 pg/mL)에 비해 높은 IL-1β를 생성하여 유의성을 보였다(p<0.05). 100, 250 μg/mL 농도 첨가시에도 각 각 32.51±5.05, 49.74±5.35 pg/mL로 대조군 3.71±0.54 pg/mL에 비해 높은 IL-1β를 분비능을 보였다(p<0.05). 또한 500, 1,000 μg/mL 고농도의 연근 열수추출물을 첨가한 경우에서도 각각 47.92±4.89, 19.49±3.33 pg/mL로 유의적인 분비량을 나타냈다 (p<0.05). 이는 연근 열수추출물이 외부에서의 항원자극에 대 항하여 면역반응을 증진시킬 가능성이 있음을 보여주는 결과 로 보여진다. 관련 연구 사례로는 더덕 물 추출물 100 μg/mL 농도군에서 림프구가 증식되었다는 연구 결과가 있다(Lee 등 1995). 25 μg/mL 농도의 더덕 물 추출물 첨가군에서 더덕 추 출물을 첨가하지 않은 군에 비해 림프절 세포가 11.2배 증식 되었다는 또 다른 연구가 보고된바 있다(Lee JH 2002).

    2) TNF-α 분비량

    TNF-α 분비량의 결과는 Fig. 2에 나타내었다. 본 실험에서 양의 대조군 첨가의 경우, 2,499.09±215․23 pg/mL로 유의적 인 분비량을 보였고, 음의 대조군은 180.28±29.20 pg/mL의 TNF-α가 분비되었다. 연근 열수추출물 5, 10, 50, 100, 250, 500, 1,000 μg/mL 농도를 첨가한 경우, 각 농도별 356.46±88.56, 280.28±30.77, 698.86±82.09, 557.12±73.49, 750.15±82.98, 679.74± 102.62, 680.74±79.22 pg/mL로 50~1,000 μg/mL의 농도군에서 유의적으로 높은 TNF-α 분비량을 보였다(p<0.05). 이러한 결 과에 의하면 연근 열수추출물은 면역세포에 하나인 마크로 파지를 활성화시켜 초기 염증반응을 유도할 것으로 사료된 다. 따라서 연구결과를 종합해 보면 연근 열수추출물을 첨가 한 50~1,000 μg/mL 농도에서 높은 분비량을 나타내어 유의성 을 보였다. 이러한 결과는 100~1,000 μg/mL 농도에서 유의성 을 보여준 질경이 물 추출물의 면역효과(Ryu & Kim 2004)와 50~1,000 μg/mL 농도 모두에서 유의적인 생성량을 나타낸 가 시오가피 물 추출물 결과(Ryu HS 2015)와 유사한 경향을 나 타내었다. 이와 같은 결과에 따라 연근 열수추출물이 면역 세 포 활성을 높여 면역증식 효과를 나타낼 가능성이 있을 것으 로 보여진다. TNF-α는 T 림프구의 성장 및 활성에 관여하여 암세포의 세포 용해를 유도함으로써 항암 작용을 나타내는 것으로 보고되어 있다(Balkwill 등 1990).

    3) IFN-γ 분비량

    IFN- γ 분비량은 Fig. 3에 나타내었다. 음의 대조군에서는 56.78±10.08 μg/mL를 나타냈고, 양의 대조군에서 3,420.95± 325.3 μg/mL로 유의적인 분비량을 나타내었다(p<0.05). 연근 열수추출물 5, 10, 50, 100, 250, 500, 1,000 μg/mL를 첨가한 농도군에서 각각 286.27±51.09, 453.51±78.29, 484.05±93.03, 810.19±87.62, 979.62±84.33, 654.06±72.09, 90.96±24.19 pg/mL 의 IFN-γ 생성량을 보여, 1,000 μg/mL의 농도를 제외한 농도 군에서 유의적인 차이를 보였다(p<0.05). 이는 질경이 물 추 출물을 첨가한 50~1,000 μg/mL 농도에서 높은 분비량을 나타 낸 연구결과와 유사한 경향을 보여주었으며, 연근 열수추출 물의 면역활성 효과의 가능성을 보여준 결과라 할 수 있다. 따라서 연근 열수추출물이 외부에서 항원이 자극할 경우, 이 에 대응하여 면역활성 효과를 보여준 결과라 할 수 있다. 느 타리버섯 물 추출물 투여 연구에서도 5~500 μg/mL의 농도에 서 IFN-γ 분비량을 촉진시킨 것으로 보고된바 있다(Ryu HS 2014).

    요약 및 결론

    In vitro 실험을 통한 연근 열수추출물 투여가 마우스의 면 역세포 활성에 미치는 영향에 대한 연구결과, 대조군에 비해 연근 열수 추출물을 투여한 50~500 μg/mL 농도에서 비장세 포 증식능을 보였으며, IL-1β, IFN-γ, TNF-α 사이토카인 생성 량을 측정한 결과에서도 IL-1β, IFN-γ, TNF-α 사이토카인 모 두 50~500 μg/mL 농도에서 대조군보다 유의적으로 높은 분 비량을 보였다. 이러한 결과에 의하면 연근 열수추출물은 마 우스 비장 세포를 활성화하여 면역 기관의 주요 기능을 증진 시키고, 사이토카인 분비량에도 영향을 줄 것으로 보인다. 따 라서 연근 열수추출물이 면역 증진 식품 소재로 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

    감사의 글

    이 논문은 2018년도 상지대학교 교내연구비 지원에 의한 것임.

    Figure

    KSFAN-32-3-246_F1.gif
    IL-1β production by activated peritoneal macrophage cultured with Nelumbo nucifera water extracts.

    * Significant difference from control at p<0.05. 1) Means±S.D. a~f: Means with different superscript (a~f) within a column significantly different from each other (p<0.05) as determined by Duncan's multiple range test (a<b<c<d<e<f).

    KSFAN-32-3-246_F2.gif
    IFN-γ production by activated peritoneal macrophage cultured with Nelumbo nucifera water extracts.

    * Significant difference from control at p<0.05. 1) Means±S.D. a~f: Means with different superscript (a~f) within a column significantly different from each other (p<0.05) as determined by Duncan's multiple range test (a<b<c<d<e<f).

    KSFAN-32-3-246_F3.gif
    TNF-α production by activated peritoneal macrophage cultured with Nelumbo nucifera water extracts.

    * Significant difference from control at p<0.05. 1) Means±S.D. a~d: Means with different superscript (a~d) within a column significantly different from each other (p<0.05) as determined by Duncan's multiple range test (a<b<c<d).

    Table

    Proliferation index of mice splenocyte cultured with water extracts of Nelumbo nucifera and mitogen

    Reference

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