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ISSN : 1225-4339(Print)
ISSN : 2287-4992(Online)
The Korean Journal of Food And Nutrition Vol.32 No.2 pp.138-147
DOI : https://doi.org/10.9799/ksfan.2019.32.2.138

Antioxidative Activities and Inhibitory Effects on Lipid Accumulation of Extracts from Different Parts of Morus alba and Cudrania tricuspidata

Gun-Hee Kim†, Eunhyang Kim*
Professor, Dept. of Food and Nutrition, Duksung Women’s University, Seoul 01369, Korea
*Master’s Course, Dept. of Food and Nutrition, Duksung Women’s University, Seoul 01369, Korea
Corresponding author: Gun-Hee Kim, Professor, Dept. of Food and Nutrition, Duksung Women’s University, Seoul 01369, Korea. Tel: +82-2-901-8496, Fax: +82-2-901-8661, E-mail: ghkim@duksung.ac.kr
13/03/2019 11/04/2019 17/04/2019

Abstract


In this study, we examined antioxidative effects and the anti-adipogenesis effect of different parts of Cudrania tricuspidata (C), and Morus alba (M). Total polyphenol contents were highest in M-root (34.56±0.045 mg GAE/g), and there was no significant difference, between C-root and M-leaf. Total flavonoid contents of C-root were highest (23.07±0.004 mg QE/g). To examine antioxidant activities of C and M extracts, DPPH and ABTS radical scavenging activity, and FRAP assay, was used. Results show that antioxidant activities of C and M extracts increased, in a dose-dependent manner. Adipocytes are generated by preadipocyte differentiation, during adipogenesis. Matured adipocytes accumulate in abnormal and cause obesity. We investigated effects of leaf and root extracts of C and M, on lipid accumulation, in 3T3-L1 adipocytes. Changes in cell morphology, and degrees of lipid accumulation in adipocytes, were evaluated by Oil Red O staining. Root extracts of C and M, reduced lipid content in a dose-dependent manner. Therefore, root extracts of C and M, may be good candidates for managing obesity.



뽕나무(Morus alba)와 꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata)의 부위에 따른 항산화 활성 및 3T3-L1세포 지방축적 억제 효과

김 건 희†, 김 은 향*
덕성여자대학교 식품영양학과 교수
*덕성여자대학교 식품영양학과 석사과정

초록


    서 론

    최근 우리나라는 가족형태 등의 사회 환경의 변화로 식생 활이 서구화되면서 비만 인구가 증가하고 있다. 비만은 열량 의 섭취와 소비가 불균형을 이룰 때 지방세포 수 또는 크기의 증가로 인하여 유발되며, 당뇨병, 고지혈증, 동맥경화, 심혈 관 질환 및 암 등의 다양한 만성 질환의 위험을 증가시키는 것으로 보고되었다(Rosen 등 2000).

    3T3-L1 지방세포는 지방전구세포 단계에서 여러 호르몬과 전사인자들이 작용하여 분화되면서 생성되며, 세포 내 중성지 방을 축적한다. 특히, Peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR) γ와 CCAAT/enhancerbinding protein(C/EBP) α가 함께 작용하여 지방조직을 형성하고 축적한다. 이렇게 분화된 지 방세포는 지질 및 에너지 대사에 중요한 역할을 하는 것으로 보고된다(Rosen & MacDougald 2006;Ahn 등 2012).

    한편, 자유라디칼은 체내 대사과정에서 필연적으로 생성 되나, 불안정하며 반응성이 커서 세포막 인지질의 불포화 지 방산을 공격하고 과산화지질을 생성하여 DNA 손상, 암 유발 및 세포의 노화 등 생체 기능 저하하여 현대인의 여러 질병 유발의 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Fukuzawa & Takaishi 1994). 최근 연구를 통해 지방세포 형성에 활성산소종이 밀접 한 연관을 갖는다는 연구가 보고되었다(Lee 등 2012;Seo 등 2013). 비만은 그 자체로도 산화 스트레스를 유발할 수 있고, 지방세포로 분화되는 대사과정으로 인하여 끊임없이 ROS가 생성되어 adipocytokines의 조절 장애와 대사증후군의 초기 발병 원인이 되는 것으로 보고되었다(Halliwell B 1996). 축적 된 지방은 NADPH(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) oxidase를 활성화시키고 ROS 생성을 유도하며, 상승된 ROS가 혈 중 산화스트레스를 증가시키는 악순환을 일으킨다(Furukawa 등 2004). 따라서 비만에서 산화스트레스를 줄이기 위한 항산 화 체계를 강화하는 생리활성물질 개발에 대한 연구가 필요 하다.

    뽕나무(Morus alba)는 낙엽교목으로 온열대지역에 분포하 고, 뽕나무과(Moraceae)에 속한다. 우리나라의 전역에 분포하 고 있으며, 전통적으로 뽕나무의 어린 가지, 뿌리, 열매 및 잎 등은 전통적으로 약용으로 사용되어 왔다(Park 등 2012). 뽕 나무류에는 플라보노이드 화합물들이 다량 함유되어 있어 혈중 중성지방, 고콜레스테롤, 고지혈증, 동맥경화와 더불어 지질과산화로 인한 대사성질환을 억제하는데 효과가 있는 것 으로 기대된다(Enkhmaa 등 2005). 뿌리껍질은 ‘상백피’라고 하 며, 혈압강하와 피부 항노화에 효과적인 물질인 prenylflavonoid, mulberrofuran 및 oxyresveratrol 등이 보고된 바가 있으며(Ni 등 2010), 항염증과 항돌연변이 효과, 당뇨, 빈혈과 심혈관계 질환(Enkhmaa 등 2005), 항균효과, 항산화효과, 항고지질혈 증(Enkhmaa 등 2005) 및 비만개선 효과 등이 알려져 있다. 뽕 나무 잎은 ‘상엽’이라 하며, 연구에 의하면 rutin, quercetin, isoquerctin, moracetin, deoxynojirimycin, calistegin, GABA, morusin, umbelliferone 등 다양한 flavonoid 성분뿐만 아니라(Zhishen 등 1999), pectin, cellulose 등의 식이섬유소나 아미노산, protein 등이 풍부하고, 항균, 항산화활성 등 생리활성물질이 다 량 함유되어 있다(Russo GL 2007). 최근 당뇨, 고지혈증, 고혈 압 및 암 등 만성 질환에 대한 효과가 보고되었으며, 예로부 터 각기병, 부종, 상처, 식은땀 및 중풍 등에 효과가 있어 한 약재로 많이 사용되고 있다(Jeon & Kim 2011).

    꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata) 또한 뽕나무과(Moraceae) 에 속하고, 한국, 일본, 중국 등지에 주로 분포하고 있다. 잎은 한방에서 폐결핵, 만성요통, 타박상, 급성관절염 등의 치료에 사용되고 있었으며(Lee 등 2009), 민간요법으로 간암치료를 위하여 꾸지뽕나무를 다려서 마시면 효과적인 것으로 알려 져 있다. 최근 연구에서 kaempferol, kaempferol 7-0-β-D-glucopyranoside, kaempferide 7-0-β-dglucopyranoside, naringenin 7-0-β-D-glucopyranoside(Park 등 1992), 6,8-p-hydroxybenzenyltaxifolin, 8-p-hydroxybenzenyltaxifolin, 6-p-hydroxybenzenyltaxifolin(Fujimoto & Nomura 1985) 등의 다양한 성분 연구가 보 고되었으며, 항암활성(Lee 등 1996), 항산화(Choi 2009), 항균 활성(Kim 등 1993;Lee 등 2004), 항당뇨(Park 등 2001), 지질 과산화 억제작용(Cha 등 2000) 및 세포독성(Kang 등 2002) 등 이 보고되었다.

    기존의 연구 결과를 통하여 꾸지뽕나무와 뽕나무의 잎과 뿌리에 함유된 성분들은 다양한 약리작용이 보고되었으며, 그 활용 방안에 대한 연구들이 보고되어지고 있지만, 부위별 비만을 억제하는 효능과 관련된 연구는 아직까지 미비한 실 정이다. 따라서 본 연구에서는 뽕나무와 꾸지뽕나무의 뿌리, 잎 및 열매로 부위를 나누어 추출 후 항산화 활성을 측정 후 부위에 따른 항산화 기능성 효과를 비교하였다. 또한, 3T3-L1 지방전구세포에 뽕나무와 꾸지뽕나무의 잎, 뿌리 추출물을 처리한 후 지방세포로 분화되는 과정에서 지방축적 억제 활 성을 확인하였다.

    재료 및 방법

    1. 실험재료

    본 연구에 사용된 꾸지뽕나무 뿌리(Cudrania tricuspidata Root, CR), 꾸지뽕나무 잎(Cudrania tricuspidata leaf, CL), 꾸 지뽕나무 열매(Cudrania tricuspidata fruit, CF), 뽕나무 뿌리 (Morus alba root, MR), 뽕나무 잎(Morus alba leaf, ML), 뽕나무 열매(Morus alba fruit, MF)는 경동시장에서 건조된 것을 구입 하여 실험에 사용하였다. 3T3-L1 세포주는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 분양 받았 다. 세포실험에 사용된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), Fetal bovine serum(FBS), Penicillin-streptomycin 및 Phosphate buffered saline(PBS)은 Gibco(Waltham, MA, USA)에 서 구입하였다. 기타 모든 시험 용액 및 시약은 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다.

    2. 추출물 제조

    추출물은 건조시료 10 g을 70% 에탄올 150 mL에 잠기도 록 하여 50℃에서 4시간 동안 추출하였고, 2회 반복하였다. 혼합한 추출 용액은 여과하여 농축하여 용매를 완전히 제거 한 후에 DMSO에 용해하여 stock solution을 만든 후 증류수 (D.W.)로 농도별 희석하여 사용하였다.

    3. 총 페놀 함량 측정(Total phenolic content: TPC)

    총 페놀 함량은 Folin-Denis법(Gutfinger J 1981)을 본 연구 에 맞게 수정하여 사용하였다. 각 추출물과 Foline-Ciocalteau 시약 동량(0.05 mL)을 넣고 섞어 3분 후 5% Na2CO3 용액 0.1 mL씩을 가한 후 어두운 곳에 2시간 정치한 후 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질로 갈산을 사용하여 표준곡선 을 나타낸 후 총 페놀 함량을 계산하였다.

    4. 총 플라보노이드 함량 측정(Total flavonoid content: TFC)

    총 플라보노이드 함량은 Moreno 등(2000)의 방법을 적절 하게 수정하여 사용하였다. 추출물 20 μL와 10% 질산암모늄 용액 4 μL를 섞고 실온 암소에서 40분간 반응을 시켰다. 그 다음 1 M Potassium acetate 4 μL와 80% 에탄올을 172 μL 가 한 후 40분간 다시 반응시켰다. 그 후 415 nm에서 흡광도를 측정하고 퀘르세틴을 이용하여 표준곡선을 작성한 후 총 플 라보노이드 함량을 나타내었다.

    5. DPPH 라디칼 소거능

    각 추출물의 DPPH 라디칼 소거능은 Blois MS(1958)의 방 법을 기반으로 측정하였다. 추출물과 0.2 mM DPPH 용액을 동량 섞은 후 암소에서 30분간 방치하고 515 nm에서 흡광도 를 측정하였다. DPPH 라디칼 소거활성은 다음 식에 의하여 나타내었다.

    전자공여능  ( % ) = ( 1 시료흡광도 대조구흡광도 ) × 100

    6. ABTS 라디칼 소거능

    ABTS 라디칼 소거능은 Re 등(1999)을 기반으로 측정하였 다. 7.4 mM ABTS 용액과 2.6 mM 과황산칼륨을 갈색병을 이 용하여 혼합한 후, 24시간 반응시킨 후 732 nm에서 흡광도가 0.7±0.03이 되도록 PBS(pH 7.4)로 희석하여 사용하였다. 추출 물 0.05 mL에 ABTS 용액 0.15 mL를 처리하여 갈색병 안에 10 분간 방치한 다음 732 nm에서 흡광도를 측정하였으며, ABTS 라디칼 소거활성은 다음 식에 의하여 나타내었다.

    ABTS 라디칼소거능  ( % ) = ( 1 시료흡광도 대조구흡광도 ) × 100

    7. 환원력(FRAP) 측정

    FRAP(ferric reducing antioxidant power) 법에 의한 항산화 활성은 Benzie & Strain(1996)의 방법을 수정 후 사용하였다. Sodium acetate buffer(0.3 M, pH 3.6), 40 mM HCl로 용해한 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ, Sigma), 20 mM FeCl3 을 각각 10:1:1(v/v)로 섞어 FRAP 용액을 만들고 37℃를 유지 하여 실험에 사용하였다. 농도별 추출물 0.05 mL에 FRAP 용 액 0.15 mL를 가하여 37℃에서 25분간 반응시키고 593 nm에 서 흡광도를 측정하였다.

    8. 3T3-L1 지방전구세포 배양 및 분화

    3T3-L1 지방전구세포를 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin이 포함된 DMEM에 넣고 37℃, 5% CO2에서 배양하였 다. 지방전구세포를 분화 유도하기 위해서 DMEM에 분화유 도 호르몬(0.5 mM IBMX, 0.5 μM DEX, 10 μg/mL Insulin: MDI) 을 혼합하여 분화를 유도하였다. 배지는 2일마다 인슐린(10 μg/mL)이 포함된 DMEM 배지로 교환하였고, 8일차까지 분 화시켰다. 분화억제 효능을 확인하기 위해 분화유도 배지에 각 추출물을 25~400 μg/mL 농도로 배지에 희석하여 처리하 였다. 대조군(MDI)은 추출물을 처리하지 않고 분화 유도한 것으로 하였다.

    9. MTT assay

    꾸지뽕나무 및 뽕나무의 잎과 뿌리 추출물의 지방세포 내 독성을 확인하기 위해 MTT assay를 수행하였다. 96 well-plate 에 3T3-L1 세포를 5×104 cells/well로 심고 24시간 배양 후 농 도별 추출물을 처리하여 24시간 다시 배양하였다. 이 후 배 지를 제거하고 MTT 용액(5 mg/mL)을 각 well에 첨가하며, 4 시간동안 배양해 배지를 제거하였다. 배지가 제거된 well에 DMSO를 첨가하여 보라색으로 염색된 결정을 용해시켜 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

    10. Oil Red O 염색

    3T3-L1 세포 내 지질 축적량은 Oil Red O 염색법으로 측정 하였다(Jang 등 2018). 3T3-L1 지방전구세포의 분화 유도 8일 째 된 지방세포를 사용하였다. 배지를 제거한 뒤 PBS로 세척 하고, 4% formalin 용액으로 상온에서 15분간 고정한 후 다시 PBS로 세척하였다. 세포 내 생성된 지방구들은 Oil Red O 용 액(0.5% Oil Red O-isopropanol solution:water=3:2)으로 1시 간 동안 염색하고, PBS로 세척 후, 염색된 지방구를 현미경 으로 관찰하였다. 총 지질 축적량은 완전히 마른 well에 100% isopropyl alcohol을 첨가하여 붉은색으로 염색된 지방구를 녹 여낸 후 96 well plate에 옮겨서 540 nm에서 흡광도를 측정하 였다.

    11. 통계처리

    모든 실험은 3회 반복하였으며, 결과는 평균±표준편차로 나타내었다. 각 평균값에 대한 유의적 차이는 SPSS(version 19) 를 이용하여 Student t-test 및 ANOVA(Duncan's multiple range test)를 실시하고, 실험군 간의 평균 차이를 p<0.05 수준에서 분석하였다.

    결과 및 고찰

    1. 추출 수율과 총 페놀 및 플라보노이드 함량

    꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata)와 뽕나무(Morus alba) 부 위별 시료 추출 수율은 건조 시료량(10 g) 대비 추출 시료량으 로부터 추출 수율을 산정하였다(Table 1). 수율은 71.36%로 MF가 가장 높았으며, CF 52.90%, CL 44.50%, ML 21.90%, MR 20.80%, CR 17.50% 순서로 나타났다. Hong & Hong(2015)의 연구에서 꾸지뽕나무 부위 및 추출 용매에 따라 추출 수율이 다르게 나타났으며, 본 연구와 열매>잎>뿌리로 수율을 보인 것이 일치하였다. Choi 등(2015)의 연구에서 청일뽕 뽕나무의 부위별 에탄올 추출물의 수율은 열매 73.4%, 잎 23.9%, 뿌리 23.0%로 나타나 본 연구의 결과와 일치하였다. 이와 같이 열 매 추출물의 수율이 높은 것은 열매에 안토시아닌 색소뿐 아 니라, 당, 산 및 섬유소가 다량 함유되어 있기 때문이라 사료 되어진다.

    폴리페놀 화합물은 식물계에 수천가지 이상 존재하며, 체 내 효소단백질과 같은 거대분자들과 쉽게 결합하여 항산화, 항염증, 항암, 항당뇨, 항비만 등의 효과를 나타낸다고 보고 된다(Kim 등 2004). 플라보노이드는 폴리페놀 화합물 범주 내 속하며, 여러 생리적 기능을 나타내어 생체 내 산화작용을 억제한다(Beecher GR 2003).

    본 연구에서 꾸지뽕나무와 뽕나무의 부위별 추출물의 총 페놀 및 플라보노이드 함량을 측정한 결과는 Table 1에 나타 내었다. 꾸지뽕나무 및 뽕나무 추출물에서 모두 뿌리의 페놀 화합물의 함량은 MR 추출물이 34.56 mg GAE/g, CR 추출물 이 27.64 mg GAE/g으로 세 가지 부위 중에 가장 높은 페놀 함량을 보였다. Kim YM(2012)의 연구에서 뽕나무를 메탄올 로 추출한 부위별 추출물의 총 페놀 함량은 뿌리에서 가장 높은 함량을 보였고, 잎, 줄기, 열매의 순으로 나타나 본 연구 와 결과가 일치하였다.

    총 플라보노이드 함량 결과를 측정한 결과는 Table 1에 나 타내었다. 건조시료 무게 당 수율 대비 총 플라보노이드 함량 측정 결과, CL(4.61 mg QE/g), ML(4.49 mg QE/g), CR(4.04 mg QE/g), CF(2.12 mg QE/g), MF(1.92 mg QE/g), MR(1.13 mg QE/g) 순으로 함량을 보여 꾸지뽕나무와 뽕나무의 잎 추출물 에서 총 플라보노이드 함량이 높게 나타났다. Hong & Hong (2015)은 꾸지뽕나무 에탄올 추출물의 총 플라보노이드 함량 은 잎>뿌리>열매로 함량을 나타내었다. 꾸지뽕나무에 함유 된 다양한 플라보노이드는 뛰어난 항산화성을 나타내는 것 으로 확인되었고, 특히 잎과 근피에 플라보노이드가 많은 것 으로 알려져 있으며(Park 등 1992;Lee 등 1994;Lee SJ 2002;Chon 등 2005;Choi 등 2009), 본 연구 결과와 일치하였다. Choi 등(2009)은 이용부위와 채집시기에 다른 꾸지뽕나무의 메탄 올 추출물 항산화성을 측정하였는데, 4월에 채취된 근피에서 플라보노이드 함량이 가장 높았다. 연구 결과들이 실험재료 의 부위와 채취시기, 재배지역, 건조조건, 추출조건 및 표준 물질의 종류 등 전처리 및 분석 조건에 따라서 결과의 차이가 있으므로 향후 연구에서 보완이 필요할 것으로 사료된다.

    2. DPPH 라디칼 소거능

    DPPH 라디칼 소거법은 항산화 물질의 전자공여능으로 인 해 산화 억제의 정도를 확인하는 척도로 방법이 간단하여 항 산화물질 연구에 많이 활용된다(Kwon 등 2007). 꾸지뽕나무 와 뽕나무의 부위별 추출물의 DPPH 라디칼 소거능을 측정한 결과는 Fig. 1과 Fig. 2에 나타내었다. 모든 추출물의 DPPH 라 디칼 소거능은 시험농도 내에서 농도 의존적으로 유의적으로 증가하였으며, 추출물 중 CR이 가장 높게 나타났다. 다음으 로 MR, ML, CL, CF, MF의 순으로 부위는 뿌리, 잎, 열매 추 출물에서 전자공여능이 강하게 나타났고, 이는 총 페놀 함량 과 같은 경향으로 나타났다. Lee 등(2011) 및 Choi 등(2009)의 연구에서 꾸지뽕나무 부위별 추출물의 항산화 활성도 본 연 구의 결과와 동일한 결과를 나타내었다.

    3. ABTS 라디칼 소거능

    ABTS 라디칼 소거능은 과황산칼륨의 반응에 의해 생성된 라디칼이 추출물 내 항산화 물질에 의해 제거되는 정도로 항 산화 활성을 측정하는 방법이다(Re 등 1999). 꾸지뽕나무와 뽕나무의 부위별 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성은 Fig. 3 과 Fig. 4에 나타내었다. 모든 추출물의 ABTS 라디칼 소거능 은 시험농도 내에서 농도 의존적으로 증가하였으며, 125~250 μg/mL에서는 MR이 가장 높았고, 다음으로 CR이 나타났다. 500~1,000 μg/mL에서는 열매를 제외한 모든 추출물이 80% 이상의 높은 소거활성을 보여 우수한 항산화력을 갖는 것으 로 판단된다. 또한 ABTS 라디칼 소거활성은 DPPH 라디칼 소거활성에 비하여 다소 높게 측정되었는데, 플라보노이드 등의 폴리페놀은 치환기의 위치에 따라 라디칼 소거능이 달 라지며(Park & Kim 2004), ABTS 라디칼에 반응하여 제거하 는 반면 DPPH 라디칼은 소거하지 못하는 경우가 보고되었다 (Wang 등 1998).

    4. 환원력(FRAP) 측정

    환원력은 항산화 능력을 확인할 수 있는 주요 인자로 항산 화제와 같이 환원력을 가진 물질은 Fe3+를 Fe2+ 형태로 환원 시켜 푸른색을 띄게 한다(Kim 등 2011). 발색정도를 흡광도 수치로 확인하여 그 값이 클수록 환원력이 높은 것으로 나타 낸다. 꾸지뽕나무와 뽕나무의 부위별 추출물을 125~1,000 μg/ mL의 농도에서 환원력을 측정한 결과, 농도 의존적으로 활 성이 증가하는 것으로 확인되었다(Fig. 5와 Fig. 6). CL보다 ML이 높게 나타났고, 부위별로는 뿌리>잎>열매 순으로 나타 났다. 1,000 μg/mL에서 FRAP 값은 CF가 0.81(O.D.)로 MF의 0.42(O.D.)보다 두 배 가까이 환원력이 높게 나타났다. 또한 환원력 측정 결과는 DPPH 라디칼 소거활성과 유사한 결과의 활성능을 나타내었다.

    5. 꾸지뽕나무와 뽕나무의 잎과 뿌리 추출물의 지방세포 내 독성평가

    MTT assay는 세포의 미토콘드리아 탈수소 효소작용에 의 하여 노란색의 수용성 기질을 자주색을 띄는 비수용성의 결 정으로 환원시키는 미토콘드리아의 능력을 이용한 방법으로 세포 생존율을 측정하는 대표적인 방법이다(Carmichael 등 1987). 본 연구에서는 페놀성 화합물을 많이 함유하고 있고, 강한 항산화 활성을 나타냈던 꾸지뽕나무와 뽕나무의 잎과 뿌리 추출물의 25, 50, 100, 200 및 400 μg/mL 농도에서 72시 간 동안 실험을 진행하였으며, 그 결과를 Fig. 7과 Fig. 8에 나타내었다. 꾸지뽕나무와 뽕나무의 잎 추출물은 400 μg/mL 농도까지 세포독성이 나타나지 않았다. 반면, 뿌리 추출물을 처리한 경우, CR은 200 μg/mL 농도부터 생존율 억제를 나타 내었고, MR은 400 μg/mL 농도에서 생존율이 억제되었다. 따 라서 지방 축적 저해 효과를 확인하기 위한 Oil red O 시험에 서는 꾸지뽕나무와 뽕나무의 잎 추출물은 세포 생존율에 영 향을 미치지 않는 농도 범위인 25~400 μg/mL를 사용하였 으며, 뿌리 추출물은 유의적으로 세포독성을 나타내지 않는 25~100 μg/mL의 농도에서 실시하였다(p<0.05).

    6. 지방전구세포 내 지질생성에 대한 꾸지뽕나무와 뽕나 무의 잎과 뿌리 추출물의 효과

    지방세포로의 분화과정에 생성되는 지방구는 중성지질이 축적되면서 만들어진다(Padilla-Benavides 등 2016). 중성지방 은 포도당과 함께 체내 에너지원으로 사용되고, 남으면 다시 체내에 축적되어 비만의 원인이 되며, 여러 만성질환의 원인 이 된다(Hafiz 등 2004;Labreuche 등 2009). 지방세포 내 지방 축적 억제 효능을 확인하기 위해 지방전구세포 분화 유도와 함께 세포독성이 관찰되지 않은 농도범위의 잎 추출물 및 뿌 리 추출물을 처리하였다. 지방구를 특이적으로 염색하는 Oil red O 염색시약으로 처리하여 관찰한 결과는 잎 추출물은 Fig. 9와 Fig. 10에 나타내었고, 뿌리 추출물은 Fig. 11과 Fig. 12에 나타내었다. 추출물을 처리하지 않은 대조군(MDI)에서 추출물을 처리한 시험군에 비하여지방구의 형성이 다량으로 관찰되었다. CL과 ML 추출물을 농도별(25, 50, 100, 200 및 400 μg/mL)로 처리했을 때 대조군(MDI)에 비해 세포 내 지방 의 축적이 저해되는 것이 확인되었다. CL 추출물을 처리했을 때 각각 35.5%까지 억제효과를 나타내었고, ML 추출물을 처 리했을 때 각각 37.3%까지 억제효과를 나타내었다(Fig. 10).

    뿌리 추출물 또한 농도별(25, 50 및 100 μg/mL)로 처리하였 을 때 대조군(MDI)에 비해 농도 의존적으로 지방의 축적이 저해되는 것이 확인되었다. CR 추출물 처리구는 45.9%까지 억 제되는 효과를 나타내었고, MR 추출물 처리구는 각각 57.7% 까지 억제되는 것이 확인되었다(Fig. 12). 본 연구에서 꾸지뽕 나무와 뽕나무 모두 잎 추출물보다 뿌리 추출물의 지방 축적 억제 효과가 우수하게 나타났다.

    한편, 최근 지방세포 내 항산화 및 ROS 생성 억제 기전 연 구가 다양하게 수행되고 있는데, Lee 등(2013)에 의하면 총 페 놀 함량에 비하여 총 플라보이드 함량이 지방세포 내 지질축 적 및 ROS 생성에 관련이 있음이 나타났으나, 총 플라보노이 드의 함량과 지방세포 내 지질 축적 및 ROS 생성 저해와의 관련성은 각각 R=0.379(p<0.05)와 R=0.419(p<0.05)로 나타나 그 관련성이 미약한 것으로 나타났다. 반면, 총 페놀 함량은 DPPH, ABTS, FRAP 항산화법과의 상관성에서 모든 R값이 0.9 이상으로 관찰되었다(p<0.05). 이는 연구결과에 의하면 폴 리페놀 및 플라보노이드의 작용 기작이 다르기 때문으로 판 단된다.

    본 연구 결과를 바탕으로 비만예방 및 관련 질환 개선을 위한 기능성 소재로서 가능성을 나타내는 것으로 사료되나, 실제로 개발 및 적용을 위해서는 꾸지뽕나무와 뽕나무의 부 위별 유효성분 분석이 필요할 것으로 사료되며, 에너지 대사 및 신호전달계와 관련된 항비만 기전에 대한 생리화학적 해 석과 지방세포 내 항산화 기전에 대한 연구가 수행되면 좋을 것으로 판단된다.

    요약 및 결론

    본 연구에서는 꾸지뽕나무와 뽕나무 부위별 추출물의 항 산화 활성을 측정하였고, 효과가 뛰어난 잎과 뿌리 추출물에 서 지질 축적 억제 효과를 알아보았다. 총 페놀 함량은 꾸지 뽕나무와 뽕나무의 부위별 추출물 중 뿌리에서 높게 나타났 으며, 총 플라보노이드 함량은 꾸지뽕나무와 뽕나무의 부위 별 추출물의 뿌리 및 잎에서 높게 나타났다. 항산화 활성을 알아보기 위해 DPPH, ABTS 라디칼 소거 활성, FRAP 법을 이용하여 각각 측정하였으며, 125~1,000 μg/mL에서 농도 의 존적으로 활성이 증가하였다. 꾸지뽕나무와 뽕나무의 세포 생존율 측정에서 잎 추출물은 25, 50, 100, 200 및 400 μg/mL 농도에서 세포독성을 나타내지 않았고, 뿌리 추출물은 세포 독성을 나타내지 않은 25, 50 및 100 μg/mL 농도에서 실험을 진행하였다. Oil red O 염색 결과 잎 추출물을 처리한 시험군 에서 지방세포 내 중성지방 축적이 억제되는 것이 나타났다. 특히 뿌리 추출물 처리군의 지방세포 내 중성지방 생성은 대 조군에 비해 농도 의존적인 억제를 나타내었으며, 잎 추출물 보다 지방 축적 억제 효과가 크게 나타났다. 이상의 연구 결 과는 꾸지뽕나무와 뽕나무 부위별 추출물에서 뿌리와 잎이 항산화 및 항비만 효과가 있는 천연 기능성소재로 활용될 수 있는 가능성을 나타내어 향후 이를 활용한 식품 개발에 기초 자료로서 유용하게 사용될 수 있을 것으로 판단된다.

    감사의 글

    본 논문은 덕성여자대학교 2017년 교내연구 지원에 의해 이루어진 것으로 이에 감사드립니다.

    Figure

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    DPPH radical scavenging activity of the extracts from different parts of Cudrania tricuspidata.

    The results are presented as mean±S.D. from triplicate experiments. Different letters on the same colored bars means significantly different at p<0.05. CR: Root of Cudrania tricuspidata, CL: Leaves of Cudrania tricuspidata, CF: Fruit of Cudrania tricuspidata.

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    DPPH radical scavenging activity of the extracts from different parts of Morus alba.

    The results are presented as mean±S.D. from triplicate experiments. Different letters on the same colored bars means significantly different at p<0.05. MR: Root of Morus alba, ML: Leaves of Morus alba, MF: Fruit of Morus alba.

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    ABTS radical scavenging activity of the extracts from different parts of Cudrania tricuspidata.

    The results are presented as mean±S.D. from triplicate experiments. Different letters on the same colored bars means significantly different at p<0.05. CR: Root of Cudrania tricuspidata, CL: Leaves of Cudrania tricuspidata, CF: Fruit of Cudrania tricuspidata.

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    ABTS radical scavenging activity of extracts from different parts of Morus alba.

    The results are presented as mean±S.D. from triplicate experiments. Different letters on the same colored bars means significantly different at p<0.05. MR: Root of Morus alba, ML: Leaves of Morus alba, MF: Fruit of Morus alba.

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    Ferric reducing antioxidant power (FRAP) of the extracts from different parts of Cudrania tricuspidata.

    The results are expressed as mean±S.D. from triplicate experiments. Different letters on the same colored bars means significantly different at p<0.05. CR: root of Cudrania tricuspidata, CL: Leaves of Cudrania tricuspidata, CF: Fruit of Cudrania tricuspidata.

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    Ferric reducing antioxidant power (FRAP) of extracts from different parts of Morus alba.

    The results are expressed as mean±S.D. from triplicate experiments. Different letters on the same colored bars means significantly different at p<0.05. MR: Root of Morus alba, ML: Leaves of Morus alba, MF: Fruit of Morus alba.

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    Cell viability of the leaf extracts of Cudrania tricuspidata and Morus alba on 3T3-L1 preadipocytes.

    3T3- L1 cells were treated with leaf extracts at 25, 50, 100, 200 and 400 μg/mL for 72 h. The results are presented as mean±S.D. from triplicate experiments. The significance was determined by the Student’s t-test. * p<0.05 indicates statistically significant difference. CL: Leaves of Cudrania tricuspidata, ML: Leaves of Morus alba.

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    Cell viability of the root extracts of Cudrania tricuspidata and Morus alba on 3T3-L1 preadipocytes.

    Cell viability was examined by MTT assay. 3T3-L1 cells were treated with root extracts at 25, 50, 100, 200 and 400 μg/mL for 72 r. Data are presented as mean±S.D. from triplicate experiments. The significance was determined by the Student’s t-test. * p<0.05 indicates statistically significant difference. CR: Root of Cudrania tricuspidata, MR: Root of Morus alba.

    KSFAN-32-2-138_F9.gif
    Observation of lipid droplets in 3T3-L1 adipocytes treated with leaf extracts of Cudrania tricuspidata and Morus alba.

    3T3-L1 cells were stained with Oil Red O and then observed under microscope. CL: Leaves of Cudrania tricuspidata, ML: Leaves of Morus alba, Pre: Preadipocytes.

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    Lipid accumulation of leaf extracts of Cudrania tricuspidata and Morus alba in 3T3-L1 adipocytes.

    The levels of intracellular lipids were measured by Oil Red O staining. Results are presented as mean±S.D. * p<0.05 indicates statistically significant difference. CL: Leaves of Cudrania tricuspidata, ML: Leaves of Morus alba, Pre: Preadipocytes.

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    Observation of lipid droplets in 3T3-L1 adipocytes treated with root extracts of Cudrania tricuspidata and Morus alba.

    3T3-L1 cells were stained with Oil Red O and then observed under microscope. CR: Root of Cudrania tricuspidata, MR: Root of Morus alba, Pre: Preadipocytes.

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    Lipid accumulation of root extracts of Cudrania tricuspidata and Morus alba in 3T3-L1 adipocytes.

    The levels of intracellular lipids were measured by Oil Red O staining. Results are presented as mean±S.D. * p<0.05 indicates statistically significant difference. CR: Root of Cudrania tricuspidata, MR: Root of Morus alba, Pre: Preadipocytes.

    Table

    Yield, total phenolic contents and total flavonoid contents of extracts from different parts of Cudrania tricuspidata and Morus alba

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