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ISSN : 1225-4339(Print)
ISSN : 2287-4992(Online)
The Korean Journal of Food And Nutrition Vol.31 No.4 pp.457-463
DOI : https://doi.org/10.9799/ksfan.2018.31.4.457

Study on the Protective Mechanism of Vitamin C in the SH-SY5Y Cell Death Induced by the Streptozotocin

Seung-Hee Lee, Kyung-Hoon Han, Hyun-Jun Kim, Kwang-Sung Park, Sung-Hee Han*, Jung-Hee Kim**, Jae-Hyeok Heo***
Researcher, Research Institute, Seoul Medical Center, Seoul 02053, Korea
*Research Exclusively Professor, Biomedical Research Center, Korea University Anam Hospital, Seoul 02841, Korea
**Medical Doctor, Dept. of Neurosurgery, Seoul Medical Center, Seoul 02053, Korea
***Medical Doctor, Dept. of Neurology Seoul Medical Center, Seoul 02053, Korea
Corresponding author: Jae-Hyeok Heo, Dept. of Neurology Seoul Medical Center, Seoul 02053, Korea. Tel: +82-2-2276-7452, Fax: +82-2-2276-7435, E-mail: drjae93@gmail.com
24/03/2018 14/06/2018 09/07/2018

Abstract


In this study, we analyzed the protective effects of the vitamin C in the streptozotocin (STZ)-induced apoptosis using the SH-SY5Y, a neuroblastoma cell line. The cells were pretreated with the vitamin C (100 μg) for 30 min, followed by the 24-hr treatment with the 2.5-mM STZ. The cell-viability assay using the Cell Counting Kit (CCK)-8 revealed the cell-survival rate increased by 15% following the vitamin-C pretreatment compared to the STZ-only treatment. Moreover, we conducted the western-blot analysis to determine the protective effect of the vitamin C regarding the apoptosis. Compared to those in the STZ-only-treatment group, the p-ERK and Bcl-2 expressions increased in the vitamin-C-pretreatment group, whereas the p-JNK and Bax expressions decreased. The vitamin-C pretreatment increased the expression of the SOD-1, an antioxidant enzyme, by more than 30%, indicating its protective role in the STZ-induced oxidative stress. Also, we found both the intrinsic- and extrinsic-pathway mechanisms of the STZ-induced apoptosis. The results of this study sμggest vitamin C may help prevent the neurodegenerative diseases.



스트렙토조토신으로 유도된 신경세포사멸에서 비타민 C의 보호 기전 연구

이 승희, 한 경훈, 김 현준, 박 광성, 한 성희*, 김 정희**, 허 재혁***
서울의료원 의학연구소 연구원
*고려대학교 안암병원 의생명연구센터 연구교수
**서울의료원 신경외과 과장
***서울의료원 신경과 과장

초록


    서 론

    우리나라는 초고령 사회로 빠르게 진입하고 있으며, 만성 질환 및 노인성 질환의 유병률도 가파르게 증가될 것이라고 예상된다(Jeong 등 2017). 그 중 노년기에 발생하는 치매의 가 장 흔한 형태인 알츠하이머병(Alzheimer’s Disease: AD)은 기 억상실과 인지 장애를 수반하는 신경퇴행성 질환이다(Masters & Beyreuther 2006). 알츠하이머병은 시냅스 소실과 세포 외 beta-amyloid(Aβ)의 축적, 신경반(neuritic plaque) 그리고 세포 내 신경원섬유 다발(Neurofibrillary Tangle: NFT)에서 과인산 화된 tau가 나타난다(Hutton 등 1998; Younkin 1998; Sisodia 1999). 그러나 알츠하이머병은 오랜 연구 기간에도 불구하고, 현재까지 병의 정확한 원인이나 병리학적 메커니즘이 밝혀 지지 않았으며, 병의 주요 원인으로 에너지 대사 이상, 산화 적 스트레스, 그리고 미토콘드리아 장애가 기인한다고 알려 져 왔다. 최근 들어 알츠하이머병은 노화와 관련한 대사질환 (metabolic disease)과 밀접한 관련이 있으며, Hoyer S(1993) 와 Cunnane 등(2011)이 발표한 결과에서는 대뇌 글루코오스 (glucose) 대사와 대뇌 에너지 생산의 불안정이 알츠하이머병 의 중요한 발병 원인이라고 보고하였다.

    스트렙토조토신(Streptozotocin: STZ)은 glucosamine-nitrosourea 화합물로써 항생제로 사용되었으나, 췌장에서 인슐린을 분비하는 베타세포(beta cell)에 작용한다는 것을 알게 된 후, 당뇨병 실험동물 모델을 만드는데 많이 사용되어지고 있다 (Junod 등 1967). 당뇨 유발 기전은 STZ 처리 시, ROS에 의한 베타세포의 손상이라고 알려져 있으며, 세포에 처리 시 free radical을 생성하여 DNA를 손상시킨 후, 세포 사멸을 유도 하며, 지질 과산화를 일으키는 것으로 보고되었다(Zheng 등 2015). 최근 연구에서는 스트렙토조토신을 투여한 당뇨병 실 험동물 모델의 뇌에서 초기 신경퇴행성 질환의 병리학적 변 화인 염증 및 산화적 스트레스, 그리고 생화학적 변화가 나타 나는 것을 확인하였다(Wohaieb & Godin 1987). 이는 스트렙 토조토신 처리로 인하여 알츠하이머병의 주된 요인인 활성 산소(Reactiveoxygen Species: ROS)가 생성되어, 산화적 스트 레스(oxidative stress)를 유도하고, 이로 인하여 세포 및 조직들 을 손상시키게 된다는 것을 의미한다. 특히 뇌조직은 항산화 효소가 다른 조직에 비해 적기 때문에 hydrogen peroxide(H2O2), Superoxide anion(O2-), Hydroxyl radical(-OH), Peroxynitrites (ONOO-) 등과 같은 활성산소에 의한 산화적 손상을 쉽게 받을 수 있다(Reynolds 등 2007; Knott 등 2008). 그로 인하여 최근에는 신경세포 손상으로부터 신경세포를 보호할 수 있 는 물질인 항산화제에 대해 관심이 집중되고 있다. 그 중 다양한 야채와 과일에 함유되어 있는 비타민 C는 여러 조직 에 필요한 필수 대사물질이며, 우리나라의 비타민 C의 하루 필요 권장량이 다른 비타민과 비교해 높은 것은 생리학적, 생 화학적 중요한 특성을 반영한다(Kim & Jang 2004). 항산화 효과를 가지고 있어서 알츠하이머병과 같은 노화 관련 질병 에 효과가 있는 것으로 보고되었다(Heo & Lee 2005; Du 등 2012; Kwon 등 2014). 더욱이 비타민 C는 중추신경계에 많이 축적되어 있으며, 신경전달 물질의 합성과 조절에 관여하는 것으로 보고되었다(Sotiriou 등 2002).

    따라서 본 연구에서는 STZ를 이용하여 SH-SY5Y 신경세 포 손상을 유도한 후, 비타민 C에 의한 세포 보호효과와 세포 내 기전을 살펴보고자 하였다.

    재료 및 방법

    1 세포배양

    본 실험에서 사용한 SH-SY5Y 신경세포는 American Type Culture Collection(ATCC, USA)에서 구입하여 사용하였다. 10% FBS(Gibco, USA)와 항생제(Gentamycin, Gibco, USA) 50 μg/mL가 포함된 DMEM 배지에 접종하여 37℃, 5% CO2 incubator(Thermo, USA)에서 배양하였다.

    2 세포 독성 평가

    세포 생존률은 Cell Counting Kit-8(CCK-8, Dojindo, Japan) 으로 측정하였다. SH-SY5Y 신경세포를 96-well plate에 1×104/ well로 접종한 후 24시간 동안 배양하였으며, 세포 독성을 알 아보기 위해 STZ(Sigma, USA)과 비타민 C(L-Ascorbic acid, Sigma, USA)를 농도와 시간에 따라 각각 처리하였다. STZ으 로 인한 세포독성에 대한 비타민 C의 보호효과는 비타민 C 를 SH-SY5Y 세포에 30분 전처리한 후, STZ을 처리하였으며, WST-8[2-(2-methoxy-4nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4- disulfophnyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt]을 10 μL 첨가 후, 3시간 반응시킨 뒤 microplate reader(TECAN, Austria)를 사용 하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

    3 단백질 분석

    Western blot을 통해 세포자멸 신호전달과 관련한 단백질 의 인산화(phosphorylation)와 항산화 관련 단백질 발현을 측 정하였다. 비타민 C를 30분 전처리한 후, 6시간과 24시간동 안 각각 스트렙토조토신 처리하여 SH-SY5Y 세포에 protease inhibitor cocktail(Roche)과 phosphatase inhibitor cocktail(Roche) 이 함유된 RIPA buffer(Sigma, USA)를 넣어 lysate를 추출하여 bicinchoninic acid(BCA, Pierce, USA)로 단백질 정량을 하였다. 20 μg의 단백질을 4~12% sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel(Invitrogen, USA)에서 전기영동한 후, PVDF membrane (Millipore, Germany)에 이동시켰다. 5% skim milk로 1시간 blocking시킨 후 1차 항체로서 ERK(Cell signaling, USA), pERK (Cell signaling, USA), JNK(Cell signaling, USA), pJNK(Cell signaling, USA), Bcl-2(abcam, UK), Bax(abcam, UK), Sod-1 (Santa Cruz, USA)을 4℃에서 12시간을 반응시킨 후, 2차 항 체를 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 단백질의 발현은 enhanced chemiluminescence(ECL, Santa Cruz, USA)를 이용하여 반응시켰으며, Chemi smart 5000(Vilber, France)을 이용하여 측정하였다.

    4 세포자멸사 관련 단백질 분석

    세포자멸사와 관련한 단백질 발현은 Human Apoptosis Array Kit(R&D system, USA)를 사용하였다. 35개의 apoptosis와 관 련한 항체가 붙어있는 nitrocellulose membrane을 1시간 동안 상온에 blocking시킨 후, 추출한 단백질 400 μg을 4℃에서 12 시간 반응시켰다. 반응 후, 1시간 동안 Detection Antibody Cocktail을 처리하였으며, Streptavidin HRP를 30분 반응시켜, chemi reagent로 가시화 하였다.

    5 통계처리

    모든 실험은 3회 이상 반복 실시하여 SPSS 20.K를 이용하 여 one way ANOVA를 시행하였으며, 유의적인 차이를 p<0.05 수준에서 검증하였다.

    결과 및 고찰

    1 STZ와 비타민 C의 독성평가

    STZ와 비타민 C에 노출된 SH-SY5Y 신경세포의 세포생존 율 변화를 알아보기 위해 각각 CCK-8 assay를 시행하였다. 다양한 농도의 비타민 C를 SH-SY5Y 세포에 24, 48, 72시간 처리하였으며, 대조군과 비교 시 세포 생존율에서 차이가 관 찰되지 않았다. 이에 본 실험에서는 SH-SY5Y 세포에 비타민 C의 처리 농도는 100 μM로 결정하였다(Fig. 1(A)). 반면에 STZ를 1, 2.5, 5, 10 mM 농도로 SH-SY5Y 세포에 24시간 처리 했을 때, 대조군과 비교 시 농도의 증가에 따라서 생존율이 감소하는 것을 확인 할 수 있었다. 이에 본 실험에서는 대조 군과 비교하여 50% 이상의 세포생존율의 유의적 감소를 보 인 2.5 mM을 SH-SY5Y 세포에 처리하기로 결정하였다(Fig. 1(B)).

    2 비타민 C의 세포보호 효과

    STZ 처리에 따른 SH-SY5Y 신경세포에서 비타민 C의 보 호효과를 확인하기 위하여, SH-SY5Y 세포에 비타민 C 100 μM을 30분 전처리 후, STZ 2.5 mM을 처리하였다. 24시간 세 포 배양 후 CCK-8 assay를 이용하여 SH-SY5Y 세포의 세포 생존율을 확인한 결과, STZ 처리군보다 비타민 C를 전처리 한 군에서 SH-SY5Y 신경세포 생존율이 15% 정도 유의적으 로 증가하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2(A)). 또한, 위상차 현미경을 통하여 대조군과 STZ 처리군의 SH-SY5Y 신경세포 의 형태를 비교 관찰한 결과, STZ 처리군의 세포들은 응축 과 신경돌기 감소가 일어났으나, 비타민 C 전처리군에서는 STZ 처리군에 비해 세포의 응축과 신경돌기 감소가 줄어든 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2(B)).

    3 ERK와 JNK의 인산화

    세포사에는 외부의 물리적 영향으로 일어나는 세포괴사 (necrosis)와 세포들이 서로 신호를 주고받으며, 특정 유전자 로부터 발현하는 단백질에 의해 능동적으로 죽음을 일으키 는 세포자멸사(apoptosis)가 있다. 퇴행성 뇌질환 과정에서는 특정 부위의 신경세포들이 선택적으로 세포자멸사를 일으키 게 되며(Mattson 등 1998), 산화적 스트레스의 경우, extracellular signal-regulated kinas(ERK), p38, c-Jun N-terminal kinase(JNK) 세 가지로 구성되어 있는 Mitogen activated protein kinase (MAPK)을 활성화 시켜 신경세포에서 외인성 세포자멸사를 유도한다고 알려져 있다(Stanciu 등 2000). 이에 본 연구에서 는 STZ 처리에 따른 세포자멸에 관여하는 MAPK 기전을 살 펴보았다.

    세포증식과 관련한 p-ERK(Phospho-Extracellular signal-related kinase)와 염증 및 세포사멸에 관련한 p-JNK(Phospho-c-Jun N-terminal Kinase) 항체를 이용하여 인산화를 확인한 결과는 Fig. 3과 같다. ERK의 인산화는 STZ 처리군에서는 대조군과 비교 시 유의적으로 감소하였으나, 비타민 C 전처리군에서 는 대조군과 비교 시 단백질 발현이 유의적으로 증가함을 확 인할 수 있었으며(Fig. 3(A)), JNK의 인산화의 경우, 비타민 C 전처리군에서 단백질의 발현이 유의적으로 감소하였다 (Fig. 3(B)).

    4 Bcl-2와 Bax의 발현 분석

    세포자멸사는 크게 두 가지 경로로 진행이 되는데 외인 성 세포자멸사(extrinsic apoptosis)인 사멸수용체 경로(death receptor)와 내인성 세포자멸사(intrinsic apoptosis)인 미토콘드 리아 경로가 있다(Wang & Youle 2009; Sayers TJ 2011). 외인 성 경로는 외부에서 내부로 세포사멸 신호를 전달하는 경로 이며, Tumor necrosis factor(TNF)-α 등이 사멸 수용체와 결합 하여 caspase-3를 활성화 시켜 진행되고, 내인성 경로는 미토 콘드리아에서 Bcl-2의 조절로 Bax가 외막에 구멍을 내어 cytochrome C가 방출되면서 caspase-9을 활성화시키고, 이차 적으로 caspase-3를 활성화 시키면서 진행이 된다(Gross 등 1999; Degenhardt 등 2006). 이에 본 연구에서는 STZ으로 유 도된 세포사멸에서 미토콘드리아 경로를 통한 세포자멸사의 대표적 인자인 Bcl-2와 Bax의 단백질 발현이 비타민 C에 의 해서 조절되는지 살펴보았다. 세포사멸을 촉진하는 Bax 단백 질의 경우, STZ 처리군에서 대조군과 비교 시, 단백질 발현이 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, 비타민 C 전 처리에 의해 Bax 단백질의 발현이 감소됨을 확인할 수 있었 다(Fig. 4(A)). 또한, Bax의 작용을 억제시켜 세포자멸을 억제 하는 Bcl-2의 발현은 비타민 C 처리군과 비타민 C 전처리군 에서 각각 STZ군보다 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었 다(Fig. 4(B)).

    5 산화스트레스 억제 효과

    세포 내 활성산소를 과산화수소로 전환시켜 세포를 보호 하는 대표적인 항산화 효소인 Sod-1(superoxide dismutase-1) 의 발현을 살펴 보았다. 비타민 C를 단독 처리하였을 때 Sod-1 의 발현이 대조군에 비하여 감소하는 것으로 나타났으며, STZ 처리군에서는 Sod-1의 발현이 변화되지 않았다. 하지만 비타 민 C 전처리군에서는 대조군에 비하여 SOD-1 단백질의 발현 이 30% 이상 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이는 비타민 C가 SOD-1의 발현을 증가시켜 산화적 스트레스 로부터 세포를 보호하는 것으로 사료된다(Fig. 5).

    6 스트렙토조토신에 의한 세포사멸

    SH-SY5Y 신경세포에서 STZ에 의해 영향을 받는 세포사 멸 관련분자들을 알아보기 위하여 human apoptosis antibody array kit를 이용하여 35가지의 세포사멸 관련 단백질 발현 을 살펴보았다. 연구 결과, STZ 처리에 따라서 Cytochrome C, SMAC/Diablo(second mitochondria-drived activator of caspase/ direct inhibitor of apoptosis binding protein with low pI), TRAIL R2/DR5(Tumor necrosis factor-related apoptosis-including ligand receptor 2, Death Receptor 5), HIF-1a(hypoxia inducible factor-1a), HSP-27(heat shock protein-27)의 증가가 나타나는 것으로 확 인되었으며, 그 중 HSP-27과 SMAC/Diablo의 발현이 높은 경 향을 보였다(Fig. 6).

    본 연구결과로부터 STZ은 미토콘드리아 내부의 Cytochrome C와 pro-apoptotic protein인 SMAC/Diablo를 유출시키고, 외부 의 Death receptor인 TRAIL R2/DR5를 통해 caspase의 활성을 증가시켜 세포사멸이 유도되며, 이는 외인성 및 내인성 양쪽 경로를 통하여 세포사멸이 이루어지는 것으로 사료된다. 또 한, STZ 자극에 의해 활성산소가 증가되어 저산소적응 반응 단백질인 HIF-1a와 항스트레스 반응 인자인 HSP-27이 나타 나는 것으로 확인됐으며, 이들은 스트레스 환경에 노출될 경 우, 방어기전에 있어 중요한 역할을 하며, Hela 세포에 TNF-a 나 H2O2 적용으로 HSP-27이 증가하여 세포를 보호하는 역 할을 한다는 연구 결과와 일치하는 것으로 나타났다(Park 등 2003).

    요약 및 결론

    알츠하이머병의 발병원인과 기전에 대하여 많은 연구가 진행되었으나, 아직까지 완전히 밝혀지지 않고 있다. 이에 본 연구에서는 STZ로 유도된 세포독성으로부터 노인성 질병의 예방과 항산화 효과로 잘 알려진 비타민 C를 이용하여 SHSY5Y 신경세포 내 보호 기전을 살펴보고자 하였다.

    본 연구 결과에 의하면, STZ를 SH-SY5Y 신경세포에 처리 하였을 때, 세포사멸이 유도되는 것을 확인하였으며, 비타민 C를 전처리함으로써 세포생존도가 증가하는 것을 확인하였 다. 비타민 C가 신경세포를 보호하는 기전을 알아보기 위하 여 세포자멸사 과정에서 신호전달을 통해 다양한 유전자를 발현시키는 MAPKs의 인산화를 살펴보았다. 비타민 C 처리 시 ERK의 인산화가 증가하며, 세포증식을 유도하는 것으로 확인하였으며, ERK와는 반대로 염증, 세포사멸과 관련된 JNK의 인산화는 비타민 C에 의해 인산화가 억제되는 것으 로 확인되었다. 또한 STZ는 Bax 단백질의 발현 증가와 Bcl-2 단백질의 발현을 감소시켰으며, apoptosis antibody array로 확 인한 결과, Cytochrome C가 유도됨을 확인하였다. 이뿐만 아 니라, 비타민 C 처리에 의해 Bcl-2가 증가하여 세포사멸이 억 제되는 것을 확인하였으며, 항산화 효소인 Sod-1의 발현을 증가하는 것 또한 확인하였다. 이는 비타민 C가 항산화 방어 체계를 강화시켜 STZ에 의한 세포손상을 보호하는 것으로 사료된다.

    본 연구를 통하여 STZ로 유도된 SH-SY5Y 신경세포 손상 에서 비타민 C가 여러 기전을 통하여 세포자멸사를 억제하 여 세포를 보호하는 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 그 러나 연구는 일부 기전들만을 확인한 것으로 추후 연구에서 는 다양한 비타민 C의 농도 및 처리시간에 따른 기전의 차이 를 분석하고, 실험동물을 통한 검증 및 스트렙토조토신에 의 한 아밀로이드베타와 타우의 관련성을 확인하고자 한다.

    감사의 글

    이 연구는 2015년도 서울시 재원으로 보조금 지원을 받아 수행된 “SH-SY5Y 신경세포주를 이용한 노인성 치매에 관한 연구”의 결과로, 이에 감사드립니다.

    Figure

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    Cytotoxicity assays of Vitamin C and Streptozotocin on SH-SY5Y cells.

    Cell viability was measured by CCK-8 assay. (A) Cells were incubated with vitamin C at indicated concentrations (0~200 μM) for 24h. (B) Viability of SH-SY5Y cells were decreased with increasing streptozotocin concentration. Data present mean±S.D. and are representative of three individual experiment (p<0.05).

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    Protective effect of vitamin C against STZ-induced cell death in SH-SY5Y cells.

    SH-SY5Y cells were pretreated with vitamin C for 30 min and then exposed to STZ for 24 h. (A) Cell vialbility was measured by CCK-8 assay. Data present mean±S.D. and are representative of three individual experiment (p<0.05). (B) The morphology of SH-SY5Y cells with STZ and vitamin C treatment (mignification, ×100); CON(control): medium alone, Vit C (vitamin C): 100 μM, STZ (streptozotocin): 2.5 mM, Vit C+ STZ (vitamin C 100 μM + streptozotocin 2.5 mM).

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    Protective effect of vitamin C on MAPK signaling pathways.

    Cells were untreated (control) or treated with 2.5 μM STZ in the absence or presence of 100 μM vitamin C for 6 hr. Western blot analysis was performed with pERK, ERK, pJNK and JNK antibodies. Expression of α-tubulin was used as an internal control (p<0.05); CON (control): medium alone, Vit C (vitamin C): 100 μM, STZ (streptozotocin): 2.5 mM, Vit C+ STZ (vitamin C 100 μM + streptozotocin 2.5 mM).

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    Effect of vitamin C on STZ-induced alteration of Bcl-2 and Bax in SH-SY5Y cells.

    Cells were untreated (control) or treated with 2.5 μM STZ in the absence or presence of 100 μM vitamin C for 24 hr. Western blot analysis was performed with Bax and Bcl-2 antibodies. Expression of α-tubulin was used as an internal control (p<0.05); CON (control): medium alone, Vit C (vitamin C): 100 μM, STZ (streptozotocin): 2.5 mM, Vit C+ STZ (vitamin C + streptozotocin).

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    Effect of vitamin C on Sod-1 protein expression by STZ-induced oxidative stress in SH-SY5Y cells.

    Cells were untreated (control) or treated with 2.5 μM STZ in the absence or presence of 100 μM vitamin C for 24 hr. Western blot analysis was performed with Sod-1 antibody. Expression of α-tubulin was used as an internal control (p<0.05); CON (control): medium alone, Vit C (vitamin C): 100 μM, STZ (streptozotocin): 2.5 mM, Vit C+ STZ(vitamin C + streptozotocin).

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    Expression of apoptosis-related proteins.

    Cells were treated with or without 2.5 mM STZ for 24 h and analyzed by apoptosis antibody array.

    Table

    Reference

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