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ISSN : 1225-4339(Print)
ISSN : 2287-4992(Online)
The Korean Journal of Food And Nutrition Vol.31 No.2 pp.236-241
DOI : https://doi.org/10.9799/ksfan.2018.31.2.236

The Effects of Flammulina velutipes Water Extract on the Activation of Spleen Cell and Macrophage in Mice

Kyoung-Ok Kim, Hye-Sook Ryu*
Dept. of Food Service Management and Nutrition, Kongju National University, Yesan-gun 32439, Korea
*Dept. of Food and Nutrition, College of Health Sciences, Sangji University, Wonju 26339, Korea
Corresponding author: Hye-Sook Ryu, Dept. of Food and Nutrition, College of Health Sciences, Sangji University, Wonju 26339, Korea. Tel: +82-33-738-7641, Fax: +82-33-730-0186, E-mail: rhs7420@hanmail.net
18/12/2017 19/01/2018 06/02/2018

Abstract


Flammulina velutipes is an edible mushroom and contains a lot of fiber, vitamin B1, B2, niacin and folic acid. This study was conducted to explore the effects of the Flammulina velutipes mushroom on immune cells and immunity. Th1 cytokine productions as IFN-γ, TNF-α, and IL-2 were measured in an activated macrophage by Flammulina velutipes water extract in seven concentrations (0, 5, 10, 50, 100, 250, 500, and 1,000 μg/mL). Also, the splenocyte proliferation index was measured at 48 hours after treatment of the Flammulina velutipes water extract in seven concentrations or mitogen, LPS and ConA. The IFN-γ and TNF-α productions were increased by treatment of the Flammulina velutipes water extract. The TNF-α production was significantly higher in the 50~1,000 μg/mL Flammulina velutipes water extract treated macrophages. The IFN-γ production of macrophages treated with the Flammulina velutipes water extract increased significantly in all groups, and the highest 1000 μg/mL concentration. The splenocyte proliferation index was enhanced when the 10~1,000 μg/mL Flammulina velutipes water extracts were treated compared to the control. These primary results suggest that Flammulina velutipes may enhance the immune function by activation of the macrophage and spleen cell.



팽이버섯 열수추출물이 마우스 비장세포와 대식세포의 증식 및 활성에 미치는 효과

김 경 옥, 류 혜 숙*
공주대학교 외식상품학과
*상지대학교 보건과학대학 식품영양학과

초록


    서 론

    세계적으로 버섯류는 약 14,000여 종이 있으며, 이중 1,550 여종이 우리나라에 알려져 있다. 우리나라에 알려진 버섯 1,550여 종 중 식용 및 약용버섯은 400여 종, 독버섯은 160여 종이 보고되어 있다. 팽이버섯(Flammulina velutipes)은 담자 균으로 주름버섯목(Agaricales)에 속한다. 팽이버섯은 활엽수 인 팽나무의 고목, 뽕나무의 그루터기 등에서 기생하는 야생 종과 톱밥에 기생하는 재배종인 백색버섯이 있다. 시중에 시 판되고 있는 팽이버섯은 주로 활엽수의 톱밥을 사용한 균상 재배(mushroom culture on beds) 방식으로 재배하고 있으며, 백 색으로 가는 자루와 작은 갓 모양을 하고 있다. 팽이버섯의 생산량은 우리나라 버섯 총생산량의 22.4%를 차지하고 있 으며, 주로 한국, 베트남, 일본 등 동아시아 지역에서 많이 식 용하고 있다. 또한 2014년 국내 팽이버섯 생산량 33,259톤 중 수출량이 10,236톤으로 총생산량에 대한 수출량이 약 31% 차지하고 있어 경제적 가치도 뛰어난 품목이다(Ministry of Agriculture 2016). 팽이버섯은 glucan 7.9%, 자일란(xylan) 6.8%, 조단백 5.2%, 회분 13.7%, 섬유소 47.7%가 함유되어 있 다(Kim 등 2016). 팽이버섯에는 항암, 항산화, 항염 효과를 나타내는 생리활성 성분인 폴리페놀 100 mg%, β-글루칸 27%가 함유되어 있다(Jo 등 2010). 또한 팽이버섯에는 T 림 프구를 활성화 시키는 fungal immunomodulatory protein이 함 유되어 있어 항암작용을 한다(Ng 등 2006; Chang 등 2010). 에스트로겐의 유무에 따른 발생되는 유방암세포에서 팽이 버섯 추출물은 에스트로겐의 유무와 상관없이 유방암세포 를 사멸시켜 유방암을 억제하였다(Gu & Leonard 2006). 팽 이버섯의 항암, 항산화력, 항균 효과를 이용한 기능성 식품 들과 기능성 소재에 대한 연구로 팽이버섯 추출물을 첨가 한 생선, 육류 패티에서 지질과산화물질 생성이 억제되었다 (Bao 등 2008, 2009). 그러나 국내에서 재배되고 있는 팽이 버섯의 면역활성 효과에 따른 기능성 소재에 대한 연구는 미흡하다.

    따라서 본 연구에서는 대중적으로 식용하고 있는 재배종 의 팽이버섯 열수 추출물이 면역세포인 비장세포와 대식세 포에 미치는 영향을 검증하여, 재래종 팽이버섯의 면역효과 에 따른 기능성 소재의 개발을 위한 자료 제공과 응용에 이용 하고자 하였다.

    재료 및 방법

    1. 실험동물 및 시료 추출

    실험동물인 ICR mouse(6~7주령, 수컷)는 (주) 중앙실험동 물에서 구입하여 실험동물실(22±2℃, 55~60% 습도, 12시간 명암주기)에서 물과 사료를 자유로이 공급하여 사육하였다. 본 연구를 위한 실험동물은 상지대학교 동물실험 윤리위원 회의 승인을 받아 수행하였다(IRB 2017-09). 본 연구에 사용 된 팽이버섯은 재래종으로 동결 건조하여 분쇄기를 이용하 여 분말화하였다. 팽이버섯 분말(100 g)과 증류수(2,000 mL) 를 섞은 혼합물을 80℃ 항온수조(water bath)에서 3시간 방 치 후 여과하였다. 팽이버섯 농축액을 얻기 위하여 여과액 을 감압농축기에 넣고 환류 냉각방식으로 팽이버섯 추출물 을 얻었다. 팽이버섯 추출물은 증류수를 사용하여 5, 10, 50, 100, 250, 500, 1,000 μg/mL로 제조하여 본 연구에 이용하 였다.

    2. 시약 및 배지

    세포 배양배지로 RPMI 1640(Grand Island NY, USA), fetal bovine serum(FBS)를 이용하였다. Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서 lysing buffer, trypan blue solution, dimethyl sulfide( DMSO), 3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide(MTT), concanavalin A(ConA), lipopolysaccharide (LPS) 등을 구입하여 사용하였다. 사이토카인 분비량은 mouse cytometric bead array flex set(BD Biosciences, USA)를 이용하 여 측정하였다.

    3. 대식세포의 사이토카인 분비량 측정

    대식세포에서 분비한 사이토카인량을 측정하기 위하여 마 우스의 복강 내에서 대식세포를 분리하였다. 48 well plate에 대식세포 900 μL와 시료 또는 LPS 100 μL를 분주 후 배양기 (5% CO2, 37℃, 48 h)에 배양하였다. 대식세포 상층액의 인터 페론-γ(interferon gamma, IFN-γ), 종양괴사인자(tumor necrosis factor alpha, TNF-α), 인터루킨-2(interleukin-2, IL-2) 분비량은 mouse cytometric bead(BD Biosciences, USA)를 사용하여 측정 하였다. 각 실험관에 50 μL의 샘플과 각 사이토카인 bead를 혼합한 capture bead 50 μL를 첨가하여 1시간 동안 빛이 차 단된 실온에 방치하였다. 각각의 실험관에 50 μL mixed PE detection reagent을 첨가하고, 다시 빛이 차단된 실온에 방치 한다. 세척을 위해 wash buffer 1 mL씩 가하고 원심분리(200 g, 5 min)한 후 상층액을 버린다. 상층액을 제거한 실험관에 wash buffer 200 μL씩 가하고, FACS Canto II(BD Biosciences, USA)를 사용하여 대식세포에서 분비된 사이토카인량을 측 정하였다.

    4. 마우스 비장세포 분리

    비장 적출 전 에테르로 실험동물을 마취시켰고, 적출된 비 장의 세척과 분쇄는 RPMI 1640용액과 멸균된 유리봉을 이 용하여 세포를 유리시켜 200 μm cell strainer에 여과 후 10분 간 원심분리(4℃, 3,000 rpm)하였다. 분리된 세포현탁액의 상 층액을 제거하고 lysing buffer를 첨가한 후 다시 10분간 원 심분리(4℃, 3,000 rpm)하였다. 상층액 제거 후 RPMI 1640용 액을 첨가, 원심분리하여 비장세포를 분리하였다. 비장세포 농도를 조절하기 위해 trypan blue solution으로 염색시킨 후 hemocytometer를 이용하여 세포수를 측정하였다. 본 실험에서 사용된 비장세포 농도는 5.0×106 cell/mL로 10% FBS-RPMI 1640을 사용하였다.

    5. 비장세포 증식능 측정

    96 well plate에 각각 90 μL의 비장세포와 각각 10 μL의 팽 이버섯 추출물(처리군), ConA(양의 대조군), LPS(양의 대조 군)를 분주한 후 37℃, 5% CO2로 조절된 배양기(Sanyo, Japan) 에서 세포를 배양(24 h, 48 h, 72 h)하였다. 비장세포의 흡광도 를 측정하기 위해 각 well에 10 μL씩 MTT를 가하고, 다시 4 시간동안 배양기에 방치한 후 DMSO를 150 μL 가하였다. 흡 광도(Optical Density: O.D.)는 ELISA reader를 이용하여 540 nm 파장에서 측정하였다. 비장세포 증식지표는 음의 대조군 (0 μg/mL) O.D. 값 대비 각 처리군 O.D. 값을 이용하여 산출 하였다.

    6. 통계처리

    연구결과에 대한 통계는 IBM SPSS statistics ver. 23을 이용 하여 처리하였다. 기술통계 결과는 Mean±Standard deviation (SD)으로 표시하였다. 실험 결과, 평균간 차이는 일원분 산분석법(one-way ANOVA test)을 수행하였고, 사후검증을 위하여 다중범위검정법 중 Duncan's multiple range test를 수 행하였으며, 분석의 유의성은 p<0.05 수준에서 검정하였다.

    결과 및 고찰

    1. 팽이버섯 열수 추출물 처리에 따른 복강 내 대식세포 의 IFN-γ 분비량에 미치는 영향

    대식세포에서 분비된 IFN-γ을 측정한 결과, 양성대조군 LPS 처리군에서 가장 높은 IFN-γ 분비량을 보였고, 팽이버섯 열수추출물은 모든 처리 농도에서 대조군에 비해 유의적으 로 증가하였다(Table 1, p<0.001). 팽이버섯 열수추출물 처리 군 중 100, 250, 500 μg/mL에서 각각 44.41±2.85, 44.19±2.68, 43.18±1.91 pg/mL로 가장 낮은 증가율을 보였고, 1,000 μg/ mL에서 81.77±4.21 pg/mL로 가장 높은 증가율이 나타났다. 대식세포에서 분비하는 IFN-γ는 내재 면역과 적응 면역반응 을 유도하는 사이토카인이다. 또한 혈관 확장, 신경전달 매개, 종양 제거, 바이러스 증식 억제 작용을 하는 nitric oxide (NO)를 활성화시키는 nitric oxide synthase(iNOS) 발현을 촉진시켜 면역조절 및 항종양작용에 관여하는 역할을 한다 (Moncada 등 1991). Kim 등(2012)은 팽이버섯 추출물을 비장 세포에 처리하였을 때 물 추출물 처리 시 IFN-γ 분비량이 소 량 증가하였고, 에탄올 추출물 처리 시 대조군에 비해 약 15.5 배 증가하였다. 또한 대식세포주에 48시간 동안 팽이버섯 물 추출물을 처리하였을 때 고농도인 30, 300 μg/mL에서 NO 생 성량이 증가하였다. 팽이버섯 열수추출물에 의한 NO 생성 억 제능 연구에서는 대식세포주에 LPS와 팽이버섯 열수추출물 1,000 μg/mL를 함께 처리하였을 때 iNOS 단백질 발현을 억제 하는 것으로 나타났다(Kang HW 2012). 팽이버섯 에탄올 추 출물을 LPS처리한 대식세포인 RAW 264.7에 처리하였을 때 NO 생성량을 억제하여 항염 효과를 나타내었다(Jo 등 2010). 팽이버섯과 같은 주름버섯목과에 속하는 새송이버섯 열수 추출물을 대식세포에 처리하였을 때 대조군에 비해 5~1,000 μg/mL 처리 농도에서 IFN-γ 분비량이 증가하였다(Kim & Ryu 2017). 주름버섯목과의 느타리버섯 열수추출물을 대식 세포에 처리하였을 때 5~500 μg/mL에서 IFN-γ 분비량이 증 가하였다(Ryu 2014). 그러므로 팽이버섯 열수추출물이 대식 세포를 활성화하여 IFN-γ 분비를 증가시켜 면역반응을 향상 시킬 것으로 사료된다.

    2. 팽이버섯 열수 추출물 처리에 따른 복강 내 대식세포 의 TNF-α 분비량에 미치는 영향

    팽이버섯 열수추출물에 의해 활성화된 대식세포에서 분비 된 TNF-α량을 측정한 결과, 대조군에 비해 50~1,000 μg/mL에 서 TNF-α 분비량이 증가하였으나, 5, 10 μg/mL에서는 유의한 차이를 나타나지 않았다(Table 2, p<0.001). 대조군의 TNF-α 분비량이 490.81±38.68 pg/mL였고, 팽이버섯 열수추출물 50 μg/mL에서는 2,256.02±711.38 pg/mL로 나타나, 대조군에 비 해 약 4.6배 증가하였다. 대조군과 유의한 차이를 보인 군 중 팽이버섯 열수추출물 처리군 500 μg/mL에서 2,749.05±362.03 pg/mL, 양성대조군 LPS 처리군에서 2,917.66±1,204.49 pg/mL 로 가장 높은 TNF-α 분비량이 나타났다. 급성기 염증반응시 대식세포에서 분비되는 TNF-α는 면역세포인 T 세포의 활성 및 성장을 촉진하여 면역반응을 활성화시키고, 종양세포를 괴사시키는 역할도 한다(Balkwill 등 1990). Kim 등(2012)은 팽이버섯 추출물에 따른 비장세포에서 분비된 TNF-α 량을 측정한 결과, 물 추출물에서 소량 증가하였고, 에탄올 추출물 에서는 대조군에 비해 약 33배 증가하였다. 또한 대식세포주 에서도 팽이버섯 물과 에탄올 추출물에서 TNF-α 분비량이 증가하였으며, 물 추출물보다는 에탄올 추출물에서 높은 증 가량을 보였다. 팽이버섯과 같은 주름버섯목에 속하는 느타 리버섯 열수추출물은 250~1,000 μg/mL 농도에서, 새송이버 섯 열수추출물은 100~1,000 μg/mL 농도에서 대식세포에서 분비된 TNF-α가 증가하였다(Ryu 2014; Kim & Ryu 2017). 주름버섯목인 아가리쿠스 균사체는 인간 단구세포(human monocytes)의 TNF-α 분비량을 증가시켰다(Bernardshaw 2005). 팽이버섯은 인간 말초혈액 단핵세포(human peripheral blood mononuclear cell)에서 TNF-α 분비량도 증가시켰다(Jeurink 2008). 그러므로 팽이버섯 열수추출물은 50 μg/mL 이상의 농 도에서 대식세포의 활성을 촉진하여 TNF-α 분비량을 증가시 키고, 증가된 TNF-α는 면역세포의 활성 및 성장에 관여할 것 으로 사료된다.

    3. 팽이버섯 열수 추출물 처리에 따른 복강 내 대식세포 의 IL-2 분비량에 미치는 영향

    대식세포에서 분비하는 IL-2는 백혈구의 활성을 조절하고, T 세포의 성장과 증식을 유도하는 사이토카인이다. 팽이버섯 열수추출물이 대식세포 IL-2 분비량에 미치는 영향을 살펴본 결과, 대조군과 비교하여 유의한 차이는 보이지 않았다(Table 3). Kim 등(2012) 연구에서 팽이버섯 물 추출물에 대한 비장 세포 IL-2 분비량 변화에서 대조군과 유의한 차이를 나타내 지 않아 본 연구와 유사한 결과를 보였다. 주름버섯목에 속하 는 아가리쿠스를 인간 단구세포에 처리한 연구에서도 IL-2 분비량에 영향을 미치지 않았다(Jeurink 2008). 느타리버섯과 새송이버섯 열수추출물을 대식세포에 처리하였을 때 IL-2 분 비량에는 유의한 차이를 나타내지 않았다(Ryu 2014; Kim & Ryu 2017). 느타리버섯 열수추출물 50 μg/mL에서 대식세포 에서 분비된 IL-2량이 유의한 차이는 나타나지 않았지만, 다 소 증가한 것으로 나타났다(Ryu 2014). 큰느타리버섯 균사체 를 이용한 논문에서 큰느타리버섯 균사체 물 추출물을 첨가 한 두부에서 IL-2 분비가 증가하였다(Lee 2010). 영지버섯 다 당체는 대식세포의 IL-2 수용체 발현을 증가시켰다(Kim & Kim 1997). 팽이버섯 에탄올 추출물에는 다당체인 β-glucan 이 약 27.0% 함유되어 있고, 물 추출물에는 약 7.9% 함유되어 있어 물 추출물보다 에탄올 추출물에서 높은 다당체 함량이 나타내었다(Jo 등 2010; kim 등 2016). 그러므로 본 연구에서 는 팽이버섯 열수추출물이 IL-2 분비량에 영향을 미치는 효 과를 관찰할 수 없었으나, 추후 팽이버섯의 다당체 추출물에 대한 연구가 필요할 것으로 사료된다.

    4. 팽이버섯 열수추출물 처리에 따른 비장세포 증식에 미 치는 영향

    면역기관의 하나인 비장에는 T, B 세포 등이 모여 있으며, 항원에 대한 생체 방어기전 등에 관여하여 면역체계를 조절 한다. 팽이버섯 열수추출물 농도에 따른 마우스 비장세포 증 식능의 변화에 대한 결과는 Table 4와 같았다. 마우스 비장세 포에 팽이버섯 열수추출물 48시간 동안 처리하였을 때 대조 군과 비교하여 유의한 차이를 나타내었다(p<0.001). 특이적으 로 비장의 B 세포와 T 세포를 유도하는 미토젠 LPS와 ConA 첨가시에 가장 높은 비장세포 증식능을 보였으며, 팽이버섯 열수추출물 처리군 내에서는 5 μg/mL 농도를 제외한 모든 처리농도에서 대조군에 비해 유의적으로 높은 비장세포 증 식능을 보였다. 팽이버섯 열수추출물 10, 50, 100, 250, 500, 1,000 μg/mL 농도에서 비장세포 증식능은 각각 1.79±0.18, 1.54±0.36, 1.55±0.12, 1.67±0.27, 1.59±0.24, 1.57±0.13으로 나 타났다. 팽이버섯 열수추출물 처리군 중 10 μg/mL와 250 μg/ mL에서 가장 높은 비장세포 증식능이 나타났다. 본 연구와 유사한 결과를 보인 식용버섯에 대한 비장세포에 관한 연구 에서 팽이버섯 물 추출물 100, 300 μg/mL에서 비처리군에 비 해 비장세포 증식능이 증가하였다(Kim 등 2012). 새송이 버 섯 열수출물은 처리 48시간에서 250 μg/mL에서 가장 높은 비 장세포 증식능을 보였다(Kim & Ryu 2017). 팽이버섯 열수추 출물 처리농도에 따른 세포생존율에 대한 연구에서 신경세 포(PC-12)는 1.0 mg/mL 이상에서, 대식세포주(RAW 264.7)는 2.0 mg/mL 이상에서 세포생존력이 감소하였다(Kang 2012). 정 상 신장세포(HEK-293)에서는 주름버섯목에 속하는 느타리버 섯 물 추출물 2.0 mg/mL 이상에서 세포생존력이 감소하였다 (Choi & Ryu 2015). 팽이버섯과 느타리버섯 메탄올 추출물은 유방암 세포의 증식을 억제하는 것으로 나타났다(Jedinak & Sliva 2008). 그러므로 팽이버섯 열수추출물은 비장세포의 증 식을 유도하며, 저농도보다는 고농도에서 촉진 효과가 증가 할 것으로 사료된다.

    요약 및 결론

    팽이버섯이 면역세포인 대식세포와 비장세포의 활성에 미 치는 영향을 알아보기 위하여 활성화된 대식세포에서 분비 하는 사이토카인인 IFN-γ, TNF-α, IL-2 분비량과 비장세포 증 식능을 측정하였다. 팽이버섯 열수추출물이 대식세포 활성에 미치는 영향을 살펴본 결과, 바이러스 증식, 염증반응을 매개 하는 iNOS 활성을 촉진하는 IFN-γ 분비량과 항바이러스 활 성을 촉진시키는 TNF-α 분비량을 증가시켰으나, 백혈구 활 성을 조절하는 IL-2 분비량에서는 유의성을 관찰할 수 없었 다. 활성화된 대식세포에서 분비된 IFN-γ 량은 팽이버섯 열 수추출물의 모든 처리농도에서 증가를 나타냈으며(p<0.001), TNF-α 분비량의 증가는 50 μg/mL 이상의 농도에서 나타났다 (p<0.001). 면역세포가 집합되어 있는 비장세포의 증식능에 있어 팽이버섯 열수추출물이 미치는 영향을 살펴본 결과, 팽 이버섯 열수추출물은 비장세포의 증식을 촉진하는 것으로 나타났다. 비장세포 증식능의 증가는 팽이버섯 열수추출물 10 μg/mL 이상에서 나타났고, 특히 250 μg/mL에서 가장 높은 비장세포 증식능을 보였다(p<0.001). 그러므로 팽이버섯 열수 추출물은 대식세포의 활성화를 유도하여 염증반응에 관여하 는 IFN-γ과 TNF-α 분비량을 증가시켜 면역체계를 조절하고, 면역기관인 비장세포를 증식을 증가시킴으로써 면역세포 생 성을 촉진할 것으로 사료된다.

    Figure

    Table

    Effect of IFN-γ production on activated mice macrophages by Flammulina velutipes water extracts
    1)Letters (a<sup>~e</sup>) indicate significant differences within a column by Duncan's multiple range test at <i>p</i><0.05.
    2)Superscript mark (<sup>***</sup>) indicate statistical differences within a column at <i>p</i><0.001.
    Effect of TNF-α production on activated mice macrophages by Flammulina velutipes water extracts
    1)Letters (a<sup>~d</sup>) indicate significant differences within a column by Duncan's multiple range test at <i>p</i><0.05.
    2)Superscript mark (<sup>***</sup>) indicate statistical differences within a column at <i>p</i><0.001.
    Effect of IL-2 production on activated mice macrophages by Flammulina velutipes water extracts
    1)Letters (a<sup>~d</sup>) indicate significant differences within a column by Duncan's multiple range test at <i>p</i><0.05.
    2)Superscript mark (<sup>***</sup>) indicate statistical differences within a column at <i>p</i><0.001.
    Spleen cell proliferation index of Flammulina velutipes water extracts in mice
    1)Letters (a<sup>~d</sup>) indicate significant differences within a column by Duncan's multiple range test at <i>p</i><0.05.
    2)Superscript mark (<sup>***</sup>) indicate statistical differences within a column at <i>p</i><0.001.

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