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ISSN : 1225-4339(Print)
ISSN : 2287-4992(Online)
The Korean Journal of Food And Nutrition Vol.30 No.6 pp.1348-1358
DOI : https://doi.org/10.9799/ksfan.2017.30.6.1348

Physiological Activity of the Fermented Small Black Soybean (Rhynchosia volubilis) with a Solid State Culture of the Bearded Tooth Mushroom (Hericium erinaceum) Mycelia

Hoon Kim, Ji-Young Shin*, Ah-Rum Lee**, Jong-Hyun Hwang**,Kwang-Won Yu**
Institute for Biomaterials, Korea University, Seoul 02841, Korea.
*R&D Center, Cosis-Bio Corporation Limited, Chungbuk 27867, Korea
**Dept. of Food and Nutrition, Korea National University of Transportation, Chungbuk 27909, Korea
Corresponding author : Kwang-Won Yu, Dept. of Food and Nutrition, Korea National University of Transportation, Chungbuk 27909, Korea. +82-43-820-5333, +82-43-820-5850, kwyu@ut.ac.kr
20170911 20171025 20171128

Abstract

To enhance the physiological activity of the Rhynchosia volubilis (RV), R. volubilis (RVHE-A) and R. volubilis-added herbal powder (RVHE-B) were fermented with a solid state culture of Hericium erinaceum mycelia (HE). The total isoflavone contents of the non-fermented RV-A (489.9 μg/g) and RV-B (571.1 μg/g) were remarkably increased in fermented RVHE-A (1,836.4 μg/g) and RVHE-B (1,276.7 μg/g). In particular, aglycone isoflavones such as daidzein and genistein were significantly higher in the RVHE-A than any other sample. When hot-water (HW) and EtOH extracts (E) were fractionated from the RV and RVHE, both extracts from the RVHE-A were higher than those from the RV-A in total polyphenol and flavonoid contents. However, the RVHE-B-HW showed a lower polyphenol and flavonoid content level than did RV-B-HW. RVHE-A-HW and -E also had more potent ABTS radical scavenging activity than any extract from the non-fermented RV and other ferments (RVHE-B). In the meanwhile, RVHE-A-HW potently stimulated the production of macrophage activation-related cytokines such as TNF-α, IL-6 and IL-12 (841.7±71.3 pg/mL, 3.9±0.1 ng/mL, 179.3±30.2 pg/mL) from peritoneal macrophage more than RV-A-HW (92.5±1.5 pg/mL, 0.1±0.0 ng/mL, 37.4±5.4 pg/mL) as well as RVHE-B-HW (557.0±21.3 pg/mL, 1.8±0.0 ng/mL, 90.0±10.0 pg/mL). However, all the EtOH extracts did not show significant activity. In addition, the RVHE-A-HW showed a significantly higher intestinal immune system modulating activity through Peyer’s patch and GM-CSF production than did any other extract from RV and RVHE-B. In conclusion, these results suggest that the fermented R. volubilis with H. erinaceum mycelia possesses a possible use as an industrial application as functional food or material.


쥐눈이콩-노루궁뎅이버섯 균사체 발효물의 생리활성

김 훈, 신 지영*, 이 아름**, 황 종현**, 유광원**
고려대학교 생물신소재연구소
*(주)코시스바이오 기업부설연구소
**한국교통대학교 식품영양학과

초록


    서 론

    콩은 우리 땅에서 나고 자라는 토종 식량 작물 중 하나로 색깔에 따라서는 검은콩과 흰콩으로 분류한다. 검은콩은 지 역에 따라 서리가 내린 뒤에 수확한다고 해서 서리태라 부르 기도 하고, 껍질은 검지만 속은 푸른빛을 띤다고 해서 속청이 라고도 한다. 특히, 검은콩의 일종인 쥐눈이콩(Rhynchosia volubilis)은 껍질은 까맣고 크기는 일반 검은콩보다 훨씬 작 아 마치 쥐눈처럼 생겼다고 해서 붙여진 이름이다. 서목태라 고도 하며, 산과 들에서 난다고 해서 토종야콩이라고도 한다. 예로부터 약용으로 사용해서 검은 약콩으로 알려진 쥐눈이 콩은 기침이나 열병, 홍역, 중독 증상에 해열제나 해독제로 사용되어 왔으며, 최근에는 블랙푸드에 대한 관심 및 쥐눈이 콩의 효능이 알려지면서 식품 및 외식업체에서의 활용도가 높아지고 있다. 검은콩은 흰콩보다 인체 내의 활성산소를 제거하는 항산화 효과가 높으며, 색이 짙을수록 항산화 효 과가 높은데, 활성성분으로는 genistein과 daidzein을 포함하 는 isoflavones, phenolic acids, tocopherols, phytic acid, trypsin inhibitor와 아미노산 및 peptide들이 거론되고 있으며(Hayes 등 1977; Wei 등 1996; Kim 등 2005), 안토시아닌 색소가 흰콩 보다 4배나 많아서(Kim 등 1997) 검은콩의 대명사로 꼽힌다. 또한, 콩 성분 중 이소플라본은 유방암 예방과 재발 방지에 효과를 나타내는 것으로 알려져 있는데, 이는 이소플라본이 여성 호르몬인 에스트로겐 활성화를 돕는 phytoestrogen으로 작용하는 것에 기인하는 것으로 보고되고 있다(Kennedy AR 1995; Kwon HJ 1999; Sirtori CR 2001; Lee 등 2005). 이러한 이소플라본은 모든 종류의 콩에 함유되어 있으나, 검은콩 에 특히 많이 함유되어 있으며, 체내 흡수율도 높기 때문에 검은콩은 여성의 노화 방지효과와 함께 폐경기 여성의 갱년 기 장애감소 및 갱년기 증상 예방효과도 알려져 있고(Bae 등 1997; Kang 등 2003), 특히 phytoestrogen으로 알려져 갱년기 완화 관련 다양한 생리활성을 나타내는 비배당체인 daidzein 과 genistein 함량이 높은 것으로 보고되고 있다(Kang 등 2003; Kim 등 2005; Lee 등 2005).

    한편, 검은콩 일종인 쥐눈이콩의 유용성분 증진 및 생리활 성 강화의 기능성 쥐눈이콩을 조제하기 위하여 본 연구에서 는 미생물 고체발효를 접목하였는데, 오래전부터 한국, 중국 및 일본 등의 동아시아에서 식품 및 전통 약재로 사용하여 온 식용버섯인 노루궁뎅이버섯(Hericium erinaceum, bearded tooth mushroom, Lion’s mane mushroom) 균사체를 이용하였 다. 노루궁뎅이버섯은 주로 활엽수에서 성장하며, 다당류, 단 백질, 렉틴, hericenone, erinacol, erinacine과 terpenoid 등의 생 리활성 성분이 포함되어져 있다(Kenmoku 등 2002; Nakatsugawa 등 2003). 또한, 노루궁뎅이버섯 균사체와 자실체로부 터 배양된 astrocyte에서 nerve growth factor(NGF) 합성을 촉 진시키는 화합물인 erinacine과 hericenone이 분리되어(Lee 등 2000; Mori 등 2008) 치매 치료와 예방에 대한 노루궁뎅이버 섯의 유용성이 큰 관심을 끌게 되었다.

    따라서 본 연구에서는 발효조건에 따른 2종류 쥐눈이콩- 노루궁뎅이버섯 균사체 고체발효물의 이소플라본 함량, 특 히 생리활성이 높은 비배당체 화합물을 분석하고, 쥐눈이콩 발효물의 열수추출물과 주정추출물을 조제하여 항산화 및 면역활성을 측정해 기능성 소재로서의 활용 가능성을 타진 하고자 하였다.

    재료 및 방법

    1.쥐눈이콩 발효물 조제를 위한 노루궁뎅이버섯 균사체 종균배양

    쥐눈이콩의 생리활성을 증진시킨 쥐눈이콩-버섯 균사체 고체발효물을 조제하기 위하여 KFDA에서 식품으로 사용 이 허가된 상황버섯(Phellinus linteus), 영지버섯(Ganoderma lucidum) 및 노루궁뎅이버섯(H. erinaceum) 균사체를 농촌진 흥청 국립농업과학원 농업유전자원센터(Gyeonggi-do, Korea) 에서 분양받았다. Potato dextrose agar(PDA, Difco, Detroit, MI, USA) 평판배지에서 배양 후 액체배양으로 확보한 3종의 종 균을 쥐눈이콩에 고체발효시켜 조제한 발효물에 대한 비발 효 쥐눈이콩과의 이소플라본 함량을 비교한 결과, 쥐눈이콩- 노루궁뎅이버섯 균사체 발효물이 가장 높은 이소플라본 함 량을 나타내었다(data now shown). 따라서 쥐눈이콩의 기능 성 식품 원료로서의 활용 가능성을 높이기 위하여 쥐눈이콩 원료만의 버섯 균사체 발효물과 함께 기존 연구(Kim 등 2011; Lee 등 2016)를 통해 균사체 성장 및 생리활성 증진에 영향을 준 뽕잎과 감잎분말을 첨가한 쥐눈이콩 발효물을 조 제하여 가장 활성이 증진된 쥐눈이콩 버섯 균사체 발효물을 조제하고자 하였다. 평판배지에서 배양한 노루궁뎅이버섯 균 사체를 potato dextrose broth(PDB, Difco)가 담긴 Erlenmeyer flask에 접종하고, shaking incubator(Jeio Tech., Daejeon, Korea) 에서 7일간 배양 후 계대배양을 3회 반복하여 배양한 종균 을 쥐눈이콩(RV-A) 및 뽕잎과 감잎분말-첨가(쥐눈이콩 10% w/w) 쥐눈이콩(RV-B)에 접종(10% v/w)하여 30℃에서 10일 간 고체배양한 후 동결건조를 거쳐 쥐눈이콩 고체발효물 (RVHE-A와–B)로 조제하였다.

    2.고체발효에 의한 쥐눈이콩-노루궁뎅이버섯 균사체 발 효물 제조

    쥐눈이콩-노루궁뎅이버섯 균사체 고체발효물 제조를 위해 국내산 쥐눈이콩을 청주 이마트(Korea)에서 구입한 후 100 g 을 동량의 물로 2시간 동안 30℃에서 침지하여 내부까지 균 사체가 증식하도록 조직을 연화시켰다. 침지된 쥐눈이콩을 121℃에서 120분간 고압멸균한 후 노루궁뎅이버섯 균사체 종균 10 mL를 접종하고, 30℃에서 10일간 고체배양하여 쥐 눈이콩-노루궁뎅이버섯 균사체 발효물(RVHE-A, Fig. 1)을 조제하였다. 또한, 침지된 쥐눈이콩에 균사체 성장 및 생리활 성 증진을 목적으로 뽕잎과 감잎분말을 첨가하여 멸균하고, 노루궁뎅이버섯 균사체 종균을 접종하여 생약이 첨가된 쥐 눈이콩-노루궁뎅이버섯 균사체 발효물(RVHE-B)도 조제하였 다. 한편, 이와 같은 발효물은 60℃ drying oven(Jeio Tech)에 서 48시간 동안 건조(수분함량 10% 내외)하여 발효조건에 따 른 2종의 쥐눈이콩-노루궁뎅이버섯 균사체 발효물로 조제 하였다.

    3.쥐눈이콩-노루궁뎅이버섯 균사체 발효물의 열수 및 주 정추출물 조제

    노루궁뎅이버섯 균사체 고체발효로 조제된 2종의 쥐눈이 콩 발효물은 grinder(Bazzatra, Gyeonggi-do, Korea)에 의해 일 정크기로 분쇄한 후 열수추출물은 분쇄된 2종 쥐눈이콩 발 효물에 20배 물을 가한 후 decoction(90~95℃)으로 추출(3회) 하였으며, 원심분리로 불용성 침전물을 제거하고, 상등액은 농축 및 동결건조하여 쥐눈이콩-노루궁뎅이버섯 발효물의 열 수추출물(RVHE-A-HW와 RVHE-B-HW)로 조제하였다. 또한, 주정추출물은 5배 주정을 가하여 환류방법(3회, 50~60℃)으 로 추출하고, 원심분리(9,000×g, 4℃, 30분)로 상등액을 회수 한 후 농축 및 동결건조하여 조제하였다(RVHE-A-E와 RVHEB- E). 한편, 쥐눈이콩의 노루궁뎅이버섯 균사체 발효에 의한 생리활성 증진을 확인하기 위하여 대조군인 비발효 쥐눈이 콩 원료(RV-A와 RV-B)를 동일 방법으로 추출하여 열수추출 물(RV-A-HW와 RV-B-HW)과 주정추출물(RV-A-E와 RV-B-E) 로 조제하였다.

    4.쥐눈이콩-노루궁뎅이버섯 균사체 발효물의 이소플라 본 화합물 분석

    쥐눈이콩에 대한 노루궁뎅이버섯 균사체의 고체발효 효과 를 검토하기 위해 이소플라본 5종 화합물에 대한 발효 전․ 후의 함량분석을 통해 쥐눈이콩-노루궁뎅이버섯 균사체 발 효물의 여성 갱년기 증상 소재로서의 활용가능성을 타진하 고자 하였다. 발효물의 이소플라본 주요 화합물의 정성 및 정량분석을 위해 Wang & Murphy(1994)Lee 등(2003)의 방법을 수정하여 진행하였는데, 두류에 일반적으로 함유되 어 있는 배당체인 daidzin과 genistin 및 비배당체인 daidzein, genistein, formononetin 등의 5종 표준물질을 통해 C18 column 이 장착된 HPLC의 UV를 이용하여 분석조건을 확립하였다. 시료의 경우에는 분쇄한 2종 쥐눈이콩 발효물과 대조군인 비 발효 쥐눈이콩 200 mg에 1 N HCl 1 mL와 4 mL acetonitrile을 첨가하여 2시간 동안 교반하고, 원심분리(5,000×g, 20분, 10 ℃)로 상등액을 회수하였다. 다음으로 PVDF membrane filter (0.45 μm, Jaema Trade Inc., Gangwon-do, Korea)로 여과한 후 여과액은 Luna 5u C18(2) A100 column(250×4.6 mm, Phenomenex, Torrance, CA, USA)이 장착된 HPLC(YL 9100, Young Lin Instrument Co. Ltd., Gyeonggi-do, Seoul)에서 UV(254 nm) 로 이소플라본 화합물을 분석하였다. 용매는 water와 acetonitrile을 92:8%(v/v)의 비율로 시작하여 30분간 55:45%까지 linear gradient로 진행하였고, 35분까지 이 비율을 유지한 후 40분까지 92:8%로 복귀한 후, 50분까지 분당 1.5 mL로 흘려 주었으며, injection volume은 20 μL이었다. 한편, 이소플라본 표준물질은 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)에서 구입한 배당체(daidzin과 genistin)와 비배당체(daidzein, genistein와 formononetin)의 5종 화합물을 동일 방법으로 처리하여 사용 하였다.

    5.쥐눈이콩-노루궁뎅이버섯 균사체 발효물 용매추출물 의 항산화 활성

    2종 쥐눈이콩-노루궁뎅이버섯 균사체 고체발효물 용매추 출물의 항산화 성분인 총 폴리페놀 화합물 함량은 Folin- Ciocalteu법(Marinova 등 2005)을 이용하여 측정하였다. 즉, 용 매추출물 100 μL에 2% Na2CO3 2 mL를 가해 알칼리 조건에 서 3분간 반응시키고, 50% Folin-Ciocalteu’s reagent(Sigma- Aldrich) 100 μL를 첨가해 30분간 반응시킨 후 반응액을 750 nm에서 측정하여 총 폴리페놀 함량을 확인하였다. 표준물질 로는 gallic acid를 사용하여 검량선을 작성한 후, 총 폴리페놀 함량은 mg gallic acid equivalents(GAE)/g(발효물 용매추출물) 으로 나타냈다. 또한, 총 플라보노이드 함량은 시료를 알칼 리와 반응시켜 황색을 띠는 것을 415 nm에서 측정하여 mg quercetin equivalent(QE)/g(발효물 용매추출물)으로 나타냈다 (Stanković MS 2011). 한편, 화학적으로 안정한 자유 라디칼 인 DPPH 및 ABTS를 이용하여 쥐눈이콩 발효물 용매추출물 의 라디칼 소거능에 따른 항산화 활성을 측정하였다. ABTS 라디칼 소거능은 7.4 mM 2,2-azino-bis-(3-ethylbenzothiazoline 6-sulfonic acid)(ABTS, Sigma-Aldrich)와 2.6 mM potassium persulphate를 암소에서 12시간 이상 반응시켜 청록색 ABTS 양이온을 형성시킨 후 734 nm에서 흡광도 값이 1.5가 되도록 몰 흡광계수(ε=3.6×104 M-1 cm-1)를 이용하여 증류수로 희석 하여 사용하였다(Choi 등 2006). 이 용액에 시료 50 μL를 가 한 후, 상온에서 60분간 반응시켜 흡광도 변화를 측정하였으 며, 표준물질로는 L-ascorbic acid를 사용하여 mg ascorbic acid equivalent antioxidant capacity(AEAC)/g(발효물 용매추출물) 으로 나타내었다. DPPH 라디칼 소거능은 0.2 mM DPPH 라 디칼 용액에 발효물 용매추출물 시료 50 μL를 가한 후, 상온 에서 60분간 반응시켜 흡광도 변화를 517 nm에서 측정하고, mg AEAC/g(발효물 용매추출물)으로 나타내었다(Goupy 등 2003).

    6.쥐눈이콩-노루궁뎅이버섯 균사체 발효물 용매추출물 의 면역활성

    생후 6주령 C3H/He과 ICR 마우스(웅성)를 (주)대한실험동 물(Chungbuk, Korea)로부터 구입하여 사육조에 5마리씩 넣 고, 정수된 물과 실험동물용 펠렛사료((주)삼양사, Incheon, Korea)를 자유공급하고, 스트레스를 받지 않도록 주의하여 배양하였으며, 모든 실험은 고려대학교 실험동물윤리위원회 (KUIACUC-2016-159) 규정에 입각하여 진행하였다.

    1)마크로파지 활성

    ICR 마우스 복강에 1 mL thioglycollate medium(Sigma- Aldrich)을 주입한 뒤 96시간 후에 RPMI-1640 배지(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 세척하여 복강 내 마 크로파지를 회수한 후 1×106 cells/mL(RPMI-1640 배지)가 되 도록 분산시켰다. 세포 분산액은 96-well plate 각 well에 200 μL씩 분주한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 2시간 동안 배양하 고, 각 well plate 기벽에 부착시켜 마크로파지 monolayer를 형 성시켰다(Conrad RE 1981). 2시간 후 미부착 세포는 제거하 고, 10% FBS(Thermo Fisher Scientific)-함유 RPMI-1640 배지 를 각 well에 180 μL씩 분주한 후, 일정 농도의 시료 20 μL를 가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양해 마크로파 지를 자극하였다. 시료의 마크로파지 활성화 정도는 시료의 자극에 따라 활성화된 마크로파지로부터 배양액에 생산되 는 사이토카인(TNF-α, IL-6와 IL-12) 생산능으로 확인하였 는데, 세포배양 상등액 50 μL를 취하여 BD Biosciences(East Rutherford, NJ, USA)사 메뉴얼에 따라 ELISA법으로 측정하 고 표준물질을 이용하여 그 양을 산출하였다. 한편, 시료의 복강 내 마크로파지에 대한 독성 여부는 시료와의 배양 후 CCK-8 kit(Dojindo, Kumamoto, Japan)를 이용(Ishiyama 등 1996) 하여 세포 생존율을 측정하고, saline 대조군과 비교하여 확인 하였다.

    2)Peyer’s patch를 경유한 장관면역 활성

    Yu 등(1998)의 방법을 변형하여 측정하였는데, C3H/He 마 우스 소장벽에 존재하는 Peyer’s patch를 적출 및 파쇄하고, 여과하여 2×106 cells/mL(5% FBS-RPMI-1640)의 Peyer’s patch 세포현탁액으로 조제하고, 96 well plate의 각 well에 180 μL 씩 분주한 후 일정 농도 시료를 20 μL씩 첨가한 후, 37℃, 5% CO2 배양기에서 5일간 배양하였다. 한편, 골수세포는 동일 마우스의 대퇴부 뼈로부터 회수하여 여과 및 세척하고, 2.5× 105 cells/mL RPMI-1640(5% FBS 함유)의 세포농도로 96 well plate의 각 well에 100 μL씩 분주하고, 위에서 얻은 시료와 Peyer’s patch 세포 배양액 50 μL와 RPMI-1640 배지 50 μL를 첨가하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 6일간 배양하였다. 시료 의 Peyer’s patch를 경유한 장관면역 활성은 CCK-8 kit를 이용 하여 배양된 골수세포 생존율 및 증식정도를 측정하여 saline 대조군에 대한 골수세포 증식과의 비교를 통한 상대활성(%) 으로 나타내었다. 또한, Peyer’s patch 세포로부터 골수세포 증식을 돕는 대표적 사이토카인인 granulocyte-monocyte-colony stimulating factor(GM-CSF)의 생산정도를 확인하기 위하여 시 료와 Peyer’s patch 세포의 배양액으로부터 50 μL를 취하여 ELISA(BD Bioscience) 방법으로 측정한 후, 표준물질로부터 그 양을 산출하였다.

    7.통계처리

    생리활성 실험결과는 4개 군으로부터 얻은 평균치±S.D. (standard deviation)로 나타내었고, 통계분석은 SPSS 통계프 로그램(Statistical Package for the Social Science, Ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 분산분석(ANOVA) 을 실시한 후, 각 측정값 간의 유의성을 Duncan's multiple range test로 p<0.05 수준에서 검증하였다.

    결과 및 고찰

    1.쥐눈이콩-노루궁뎅이버섯 균사체 발효물의 이소플라 본 화합물 분석

    비발효 쥐눈이콩(RV-A)과 생약분말(뽕잎과 감잎)-첨가 쥐 눈이콩(RV-B)의 경우에는 주요 이소플라본 화합물로서 배당 체인 genistin과 비배당체인 daidzein 및 genistein만이 검출되 었는데, RV-A는 daidzein(262.7 μg/g)이 가장 많았으며, 총 이 소플라본량은 489.9 μg/g이었다. RV-B도 daidzein(281.7 μg/g) 이 가장 높은 함량을 보이면서 총 이소플라본은 571.7 μg/g으 로 RV-A보다 많았는데, 이는 쥐눈이콩에 첨가된 뽕잎과 감 잎분말 생약으로부터 기인하는 것으로 보인다(Table 1). 한편, 비발효 쥐눈이콩 원료를 노루궁뎅이버섯 균사체로 고체발효 하여 얻은 쥐눈이콩 발효물의 경우, RVHE-A에서는 총 이소 플라본 함량이 1,836.4 μg/g으로 비발효군보다 3.7배 증가하 는 결과를 보였으며, 특히, RV-A에서 161.5 μg/g과 262.7 μg/g 을 보인 genistein과 daidzein이 RVHE-A에서는 1,099.1 μ g/g(6.1배)와 667.0 μg/g(2.5배)으로 크게 증가하여 발효를 통 한 이소플라본 비배당체 증진이 뚜렷하게 관찰되었다(Table 1). 또한, RVHE-B에서도 총 이소플라본 함량이 1,276.6 μ g/g(2.2배)으로, 비배당체인 genistein(192.9 → 711.5 μg/g, 3.7 배)과 daidzein (281.7 → 444.5 μg/g, 1.6배)이 비발효 원료보다 증가하였으나, RVHE-A와 비교하여 증진효과가 낮아 생약- 첨가 쥐눈이콩의 발효가 이소플라본 화합물 증진에 시너지 효과를 나타내지는 않는 것으로 보인다(Table 1).

    Silva 등(2011)은 가압처리된 콩가루의 Aspergillus oryzae 발효물에 대한 배당체와 비배당체 구성비율을 검토한 결과, daidzin과 genistin의 배당체는 발효시간에 따라 지속적인 감 소를 보여 48시간에 원료의 65%가 감소하였으나, daidzein과 genistein의 비배당체는 12배와 35배 증가를 나타내었고, 비배 당체로의 전환은 A. oryzae로부터 생산되는 β-glycosidase 활 성에 의한 것으로 보고하였다. 또한, Aguiar와 Park(2004)도 콩 가루의 A. oryzae 발효물에서 β-glycosidase의 활성증가와 함 께 daidzein과 genistein의 비배당체 이소플라본의 증가를 보 고하였다. 본 실험에서도 쥐눈이콩의 노루궁뎅이버섯 균사체 고체발효는 이소플라본 비배당체 증진에 유효하게 작용하고 있음을 확인할 수 있었다. 이러한 비배당체는 임상실험에서 배당체보다 더 빠르고 더 많이 흡수되어져 여성의 심장질환 과 갱년기 만성질환 예방에 훨씬 효과적임이 알려져 있다 (Munro 등 2003; Zubik & Meydani 2003). 따라서 추후 쥐눈이 콩 발효물의 비배당체 전환에 관련된 β-glycosidase 등의 효 소활성을 검토하고자 한다.

    2.쥐눈이콩-노루궁뎅이버섯 균사체 발효물 용매추출물 의 항산화 활성

    쥐눈이콩 원료만을 노루궁뎅이버섯 균사체로 발효시킨 RVHE-A와 뽕잎과 감잎분말-첨가 쥐눈이콩 발효물(RVHE-B) 및 비발효 쥐눈이콩 원료(RV-A와 -B)에 대한 물과 주정 추 출물에 대한 항산화 성분인 총 폴리페놀과 플라보노이드 함 량을 측정하였다. 열수추출물에서는 RVHE-A-HW에서 폴리 페놀 함량이 67.7±2.9 mg gallic acid equivalent(GAE)/g으로 RV-A-HW(54.7±1.8 mg GAE/g)보다 증가되고 있음을 보였다 (Table 2). 그러나 생약-첨가 쥐눈이콩 발효물 열수추출물 (RVHE-B- HW)은 65.9±2.4 mg GAE/g의 총 폴리페놀 함량으 로 RVHE- A-HW보다 다소 낮았을 뿐만 아니라, 비발효 생약- 첨가 쥐눈이콩(72.3±1.9 mg GAE/g)보다도 낮아 균사체 성장 촉진이 폴리페놀 화합물 대사에 영향을 주고 있는 것으로 추 정되었다. 모든 열수추출물 중 비발효 원료인 RV-B-HW가 가장 높은 총 폴리페놀 함량을 보였는데, 이는 첨가된 뽕잎과 감잎 등의 생약으로부터 기인하는 것으로 생각된다. 또한, 이 러한 양상은 플라보노이드 함량에서도 유사하게 나타나, RVHE-A-HW(14.9±1.6 mg quercetin equivalent(QE)/g)는 비발 효 쥐눈이콩 열수추출물(14.1±1.3 mg QE/g)보다 다소 증가 된 함량을 보였으나, 생약-첨가 쥐눈이콩 발효물인 RVHE-BHW( 14.9±1.1 mg QE/g)는 RV-B-HW(16.4±0.4 mg QE/g)보다 낮은 함량을 나타내었다(Table 2).

    그러나 주정추출물은 열수추출물과 다른 결과를 보였는 데, RVHE-A-E(75.2±1.9 mg GAE/g)와 RVHE-B-E(77.9±2.3 mg GAE/g) 모두 비발효 원료(RV-A-E; 39.9±0.0 mg GAE/g, RV-B-E; 58.4±1.8 mg GAE/g)보다 총 폴리페놀 함량이 현저 히 높아 추출용매 극성에 따라 항산화 성분 함량에 차이가 있음을 알 수 있었다(Table 2). 총 플라보노이드에서도 유사 한 양상을 나타내어 발효물인 RVHE-A-E(32.7±0.6 mg QE/g) 와 RVHE-B-E(23.9±0.6 mg QE/g) 모두 비발효 대조군(RV-A-E; 10.2±0.8 mg QE/g, RV-B-E; 20.1± 0.9 mg QE/g)보다 높은 함 량을 나타내었다(Table 2). 특히, RVHE-A-E의 총 플라보노이 드 함량은 비발효 원료와 큰 차이를 나타내어 쥐눈이콩만의 노루궁뎅이버섯 균사체 발효물에서 전반적으로 항산화 성분 이 우수하게 함유되어 있음을 확인하였다.

    항산화 성분결과를 토대로 ABTS와 DPPH 라디칼 소거능 에 대한 항산화 활성을 검토하여 항산화 성분과 항산화 활 성과의 상관성을 확인하였다. 열수추출물의 ABTS 라디칼 소 거능은 총 폴리페놀 함량이 높았던 쥐눈이콩만의 발효물인 RVHE-A-HW가 78.6±5.1 mg ascorbic acid equivalent antioxidant capacity(AEAC)/g으로 RV-A-HW(33.1±2.3 mg AEAC/g)보다 높은 항산화 활성을 나타내었다(Table 3). 한편, 총 폴리페놀 함량이 비발효 원료보다 낮았던 RVHE-B-HW(41.9±0.6 mg AEAC/g)는 ABTS 라디칼 소거능에서도 비발효 원료(RV-BHW; 44.1±7.6 mg AEAC/g)보다 감소하는 결과를 나타내어 총 폴리페놀 함량과 ABTS 라디칼 소거능의 항산화 활성간에 유의적인 상관성을 확인할 수 있었다(Table 3). 또한, 이러한 총 폴리페놀 함량과 ABTS 라디칼에서의 항산화 활성간 유의 적인 상관성은 주정추출물에서 더욱 뚜렷하게 나타나, 비발 효군보다 현저히 높은 총 폴리페놀 함량을 나타내었던 발효 물인 RVHE-B-E(36.7±2.0 mg AEAC/g)와 RVHE-A-E(30.3±2.1 mg AEAC/g)는 RV-B-E(24.1±3.1 mg AEAC/g) 및 RV-A-E (18.0±1.2 mg AEAC/g)보다 높은 ABTS 라디칼 소거능을 보여 주었다(Table 3).

    한편, DPPH 라디칼 소거능의 항산화 활성에서 열수추출 물의 경우에는 전반적으로 ABTS 라디칼 소거능보다 낮은 활 성을 보일 뿐만 아니라, RVHE-A-HW(5.2±0.9 mg AEAC/g)는 비발효물(RV-A-HW; 7.2±0.8 mg AEAC/g)보다 낮은 활성을 보여 항산화 성분과의 유의적인 상관성을 보이지는 않았다 (Table 3). Kim & Park(2011)은 항산화능 측정법에 대한 분 석에서 DPPH 측정방법이 간단하지만 시료 색에 대해 방해를 받을 수 있다는 점과 단백질 함량이 높은 경우에는 결과에 영향이 크다는 보고(Sanchez M 2002)에 비추어 쥐눈이콩 열 수추출물의 높은 단백질 함량이 상관성을 영향을 미치는 것 으로 생각된다. 그러나 주정추출물에서는 발효물(RVHE-A-E; 11.6±0.7 mg AEAC/g, RVHE-B-E; 14.7±0.7 mg AEAC/g)이 비 발효 원료(RV-A-E; 5.8±0.6 mg AEAC/g, RV-B-E; 12.9±0.6 mg AEAC/g)보다 높은 항산화 활성을 나타내어 항산화 성분과 DPPH 라디칼 소거능에서 유의적인 상관성을 확인할 수 있었 다(Table 3). 이와 같은 결과로부터 ABTS와 DPPH 라디칼 소 거능에 의한 항산화 활성은 추출용매에 따라 다소 차이를 보 이고는 있지만, 전반적으로 항산화 성분 함량 결과와 마찬가 지로 열수추출물에서는 쥐눈이콩만을 노루궁뎅이버섯 균사 체로 고체발효한 RVHE-A-HW가 비발효군보다 우수하였고, 주정추출물 경우에는 뽕잎과 감잎의 생약-첨가 쥐눈이콩-노 루궁뎅이버섯 균사체 발효물(RVHE-B-E)이 비발효 원료뿐만 아니고, 발효물인 RVHE-A-E보다도 높은 활성을 나타내었다 (Table 3).

    3.쥐눈이콩-노루궁뎅이버섯 균사체 발효물 용매추출물 의 마크로파지 활성

    마크로파지는 선천면역계를 대표하는 면역세포로서 항원 물질 포식, 항원-항체복합체 제거와 염증반응 촉진 및 획득면 역세포에 항원제시 등 면역반응에 중요한 역할을 담당하므 로, 이들의 활성화는 신체의 면역강화에 중요한 수단이 될 수 있다(Jackman 등 2017). 따라서 쥐눈이콩에 생약분말 첨가 여부에 따라 노루궁뎅이버섯 균사체를 고체발효시켜 조제한 쥐눈이콩 발효물(RVHE-A와 -B) 용매추출물의 ICR 마우스 복강 마크로파지 활성에 미치는 영향을 검토하였다. 활성측 정을 위한 적절한 시료량 검토를 위하여 시료의 마크로파지 세포독성을 검토한 결과, 비발효 및 쥐눈이콩 발효물 모두 열 수추출물은 1,000 μg/mL 농도까지 거의 독성을 나타내지 않 았으나, 주정추출물에서는 1,000 μg/mL에서 독성이 관찰되어 (data not shown) 독성이 없는 100 μg/mL 농도에서 마크로파 지 활성에 관여하는 사이토카인(tumor necrosis factor(TNF)-α, IL-12와 IL-6)을 측정하여 마크로파지 활성으로 나타냈다.

    TNF-α는 활성화된 마크로파지에 의해 분비되어 면역세포 를 조절하는 중요한 사이토카인으로서 변형된 세포의 자살 을 유도하거나, 종양생성 및 바이러스 복제를 억제하는 능력 을 갖는다(Manna 등 2014). 쥐눈이콩-노루궁뎅이버섯 균사 체 발효물 용매 추출물의 TNF-α 생산에서는 쥐눈이콩만의 노루궁뎅이버섯 균사체 발효물 열수추출물(RVHE-A-HW, 841.7±71.3 pg/mL)에서 비발효군(92.5±1.5 pg/mL)보다 9.1배 의 유의적인 증가로 가장 우수한 활성을 나타내었고, 생약-첨 가 RVHE-B-HW도 557.0±21.3 pg/mL로 RV-B-HW(195.8±16.2 pg/mL)보다 2.8배 증가하였으나, RVHE-A-HW보다는 유의 적으로 낮은 결과를 보였다(Fig. 2A). 한편, 주정추출물 경 우에는 비발효물(5.6±0.4~9.3±1.4 pg/mL)보다 높은 30.1±5.3~ 135.1±2.3 pg/mL의 TNF-α 생산을 보였으나, 열수추출물보다 는 유의적으로 현저히 낮은 활성을 나타내었다(Fig. 2A).

    한편, IL-6는 활성화된 마크로파지로부터 분비되어 B 세포 계열의 증식과 항체 분비 등의 획득면역에 조절작용을 나타 내는 대표적인 사이토카인이다(Li 등 2009). IL-6에서도 TNF- α와 마찬가지로 쥐눈이콩 발효물 열수추출물만이 유의적으 로 높은 생산능을 나타내었는데, RVHE-A-HW는 3.9±0.1 ng/ mL로 비발효 쥐눈이콩(0.1±0.0 ng/mL)보다 현저히 높은 생산 능을 보였고, RVHE-B-HW도 1.8±0.0 ng/mL로 RVHE-A-HW 보다는 유의적으로 낮았으나, RV-B-HW(0.2±0.0 ng/mL)보다 는 9.0배나 높은 IL-6 생산능을 나타내었다(Fig. 2B). 그러나 주정추출물에서는 비발효군과 발효군 모두 거의 미비한 생 산을 나타내어 주정에서 주로 추출되는 폴리페놀이나 플라 보노이드 등의 저분자 물질은 마크로파지로부터 IL-6 생산에 관여하지 않는 것을 확인할 수 있었다.

    IL-12는 활성화된 마크로파지로부터 분비되어 natural killer (NK) 세포 및 보조 T 세포 등의 성숙 및 분화를 촉진시키는 사이토카인이다(Ruhland & Kima 2009). 마크로파지로부터 IL-12 생산에서도 TNF-α 및 IL-6 생산과 유사하게 쥐눈이콩 만의 발효물 열수추출물이 179.3±30.2 pg/mL 생산되어 비발 효 쥐눈이콩 열수추출물(37.4±5.4 pg/mL)보다 4.8배의 유의 적 증가를 보일 뿐만 아니라, 생약-첨가 발효물 열수추출물 (RVHE-B-HW, 90.0±10.0 pg/mL)보다도 유의적으로 높은 생 산능을 나타내었다(Fig. 2C). 그러나 주정추출물의 경우에는 RVHE-A-E가 49.1±12.2 pg/mL로 RV-A-E(21.4±2.6 pg/mL)보 다 약간 높은 활성을 보였으나, RVHE-A-HW보다는 유의적 으로 매우 낮은 수준임이 확인되었다(Fig. 2C). 결론적으로 쥐눈이콩만을 노루궁뎅이버섯 균사체로 고체배양한 발효물 은 생약이 첨가된 쥐눈이콩 발효물 및 비발효 원료보다 선 천면역 세포인 마크로파지를 자극하여 TNF-α, IL-6 및 IL-12 의 사이토카인 생산을 촉진하고, 이들이 다양한 면역세포의 분화와 증식을 활발하게 유도함으로써 면역반응과 면역조절 에 기여할 수 있어, 쥐눈이콩 발효물의 면역증진 기능성 식품 소재로서의 활용 가능성이 높음을 확인할 수 있었다.

    4.쥐눈이콩 발효물 용매추출물의 Peyer’s patch를 경유 한 장관면역 활성

    구강으로 섭취되는 식품은 소화관을 따라 이동하면서 가 수분해 후 소장에서 흡수되어 영양소를 제공해주는 영양학 적 측면에서 대단히 중요한 의의를 갖는다. 그러나 식품섭취 과정에서 다양한 외부물질이 소화관에 침투할 수 있고, 특히, 세균 및 독소 등 침투는 질병을 유발할 수 있으므로 소장에서 장관면역계(intestinal immune system)는 대표적인 점막면역계 (mucosal-associated lymphoid tissue)로서 숙주를 보호하는 최 초 방어기관의 중요한 역할을 담당하고 있다(Pierre 등 2016). 특히, 소장에는 영양소를 흡수하는 융모 이외 Peyer's patch 조 직이 발달되어 있고, M 세포를 통해 질병 유발에 원인이 되 는 외부물질을 포식하여 파괴함으로써 질병을 억제하는 대표 적인 소장 면역조직으로 알려져 있다(Mabbott 등 2013). 또한, Peyer's patch 조직은 mesenteric 림프절을 통해 전신을 순환하 였다가 복귀할 수 있는 특성을 가진 다양한 면역세포를 포함 하고 있어, Peyer's patch의 활성화는 단지 국소조직 활성에만 그치지 않고, 전신 순환면역계 활성에도 기여하는 중요한 역 할을 담당하고 있다(Yu 등 2013).

    따라서 쥐눈이콩-노루궁뎅이버섯 균사체 고체발효물의 용 매추출물이 장관면역 조직인 Peyer’s patch를 자극할 수 있다 면 이들이 인체의 전신 면역활성에도 기여할 수 있으므로, 쥐 눈이콩 발효물 용매추출물에 대한 장관면역 활성화 여부를 검토하였다. 비발효 쥐눈이콩 열수추출물은 saline 대조군과 유사한 수준으로 거의 활성을 보이지 않았으나, 주정추출물 (RV-A-E와 RV-B-E)은 1.4배와 1.8배의 활성을 보여 비발효 쥐눈이콩의 저분자 물질에서 Peyer’s patch를 자극하여 골수 세포를 증식시키는 활성성분 존재를 보여주었다(Fig. 3A). 그 러나 노루궁뎅이버섯 균사체 고체발효를 통해 얻은 쥐눈이 콩-노루궁뎅이버섯 균사체 고체발효물(RVHE-A와 -B)의 용 매추출물은 비발효 주정추출물보다 유의적으로 훨씬 높은 장관면역 활성을 나타내었는데, 열수추출물에서는 쥐눈이콩 만의 발효물이 saline 대조군의 2.8배로 유의적으로 가장 높은 장관면역활성을 나타냈고, RVHE-B-HW도 쥐눈이콩만의 발 효물인 RVHE-A-HW보다는 낮지만, 2.0배의 유의적인 활성 을 보여주었다(Fig. 3A). 주정추출물에서도 비발효군보다 높 은 활성을 나타내어 RVHE-B-E가 2.8배로 RVHE-A-HW와 유 의적 차이 없이 높은 활성을 보였고, RVHE-A-E도 2.2배의 유 의적인 활성을 나타내어 쥐눈이콩 발효물이 장관면역 활성 화에 기여함을 확인하였다(Fig. 3A).

    또한, Peyer’s patch와 시료의 배양을 통해 골수세포 증식에 관여하는 granulocyte-macrophage colony stimulating factor(GMCSF) 생산이 촉진되는지를 확인한 결과에서도 장관면역 활 성결과와 마찬가지로 RVHE-A-HW(69.2±7.4 pg/mL)는 유의 적으로 가장 높은 생산능으로 비발효군(21.1±1.9 pg/mL)의 3.3배 증가를 보였고, RVHE-B-HW(37.1±6.2 pg/mL)도 RV-BHW( 17.1±4.0 pg/mL)보다 증가된 GM-CSF 생산능을 보였다 (Fig. 3B). 그러나 장관면역 활성이 우수하였던 주정추출물은 DIW 대조군(12.7±2.3 pg/mL)보다도 낮은 2.1±0.5~2.9±1.4 pg/ mL의 생산능을 나타내(Fig. 3B) 골수세포 증식이 GM-CSF 이 외의 다른 사이토카인에 기인하는 것으로 추정되어 향후 다 양한 사이토카인의 조사를 진행하고자 한다. 결론적으로 쥐 눈이콩만의 노루궁뎅이버섯 균사체 발효물은 비발효 쥐눈 이콩 및 생약-첨가 쥐눈이콩 발효물보다도 장관면역기관인 Peyer’s patch를 자극하여 GM-CSF 사이토카인 생산을 촉진하 고, 이들이 골수세포 증식과 분화를 더 활발하게 유도하여 장 관면역 활성화에 기여함을 확인하였다.

    요약 및 결론

    쥐눈이콩(Rhynchosia volubilis, RV)의 생리활성을 증진시 키기 위하여 쥐눈이콩과 생약분말-첨가 쥐눈이콩을 노루궁 뎅이버섯(Hericium erinaceum, HE) 균사체의 고체배양을 이 용하여 발효(RVHE-A와 –B)시켰을 때 비발효물(RV-A; 489.9 μg/ g, RV-B; 571.1 μg/g)의 총 이소플라본 화합물은 발효물인 RVHE-A(1,836.4 μg/g)와 RVHE-B(1,276.7 μg/g)에서 크게 증 가되었다. 특히, daidzein과 genistein의 비배당체 이소플라본 이 RVHE-A에서 가장 높은 함량을 나타내었다. 비발효물과 발효물로부터 열수추출물과 주정추출물을 분획하였을 때 쥐 눈이콩 원료만의 발효물(RVHE-A)로부터 얻은 2가지 추출물 은 총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량에서 비발효물로부터 조제된 용매추출물보다 더 높았다. 그러나 생약분말-첨가 쥐 눈이콩 발효물의 열수추출물(RVHE-B-HW)의 경우에는 비발 효물보다 더 낮은 함량을 나타내었다. 또한, RVHE-A-HW와 –E는 ABTS 라디칼 소거능에서 비발효 쥐눈이콩과 RVHE-B 로부터 조제된 추출물보다도 유의적으로 높은 결과를 나타 내었다. 한편, RVHE-A-HW는 복강 대식세포로부터 TNF-α, IL-6와 IL-12(841.7±71.3 pg/mL, 3.9±0.1 ng/mL, 179.3±30.2 pg/mL) 등의 마크로파지 활성화 관련 사이토카인의 생산을 RV-A-HW(92.5±1.5 pg/mL, 0.1±0.0 ng/mL, 37.4±5.4 pg/mL) 뿐 만 아니라, RVHE-B-HW(557.0±21.3 pg/mL, 1.8±0.0 ng/mL, 90.0±10.0 pg/mL)보다도 더 촉진시켰다. 그러나 모든 주정추 출물은 유의적인 활성을 나타내지 않았다. 또한, 쥐눈이콩만 의 발효물 열수추출물은 Peyer’s patch를 경유한 장관면역 활 성과 GM-CSF 생산에 있어서도 비발효 쥐눈이콩과 생약분 말-첨가 쥐눈이콩 발효물로부터 조제된 어떤 추출물보다도 유의적으로 더 높은 활성을 나타내었다. 결론적으로 쥐눈이 콩-노루궁뎅이버섯 균사체 발효물은 기능성 식품 또는 소재 로서의 산업적인 적용에서 쥐눈이콩보다 더 우수함을 제시 하였다.

    감사의 글

    본 논문은 2017 한국교통대학교 지원을 받아 수행한 연구 로 이에 감사드립니다.

    Figure

    KSFAN-30-1348_F1.gif
    Pictures of fermented Rhynchosia volubilis (RVHE) with Hericium erinaceum mycelia on culture day.
    KSFAN-30-1348_F2.gif
    Cytokine production from peritoneal macrophage stimulated with solvent extract (100 μg/mL) from fermented Rhynchosia volubilis with Hericium erinaceum mycelia.

    1) Control: only saline without any extract. 2) Hot-water (HW) and EtOH extract (E) from RV-A (non-fermented R. volubilis), RVHE-A (fermented R. volubilis), RV-B (non-fermented R. volubilis-added herbs), and RVHE-B (fermented R. volubilis-added herbs). 3) The difference in lower case letter on the bar means a significant difference at p<0.05.

    KSFAN-30-1348_F3.gif
    Intestinal immune system modulating activity through Peyer’s patch (PP) of solvent extract from fermented Rhynchosia volubilis with Hericium erinaceum mycelia.

    1) Relative activity: bone marrow cell proliferation through Peyer’s patch (PP) stimulated with each extract (100 μg/mL) against those of control. 2) GM-CSF production: granulocyte macrophage- colony stimulating factor production from PP cell stimulated with each extract (100 μg/mL). 3) Control: only saline without any extract. 4) Extracts name: refer to Fig. 2. 5) The difference in lower case letter on the bar means a significant difference at p<0.05.

    Table

    Isoflavone compound content of fermented Rhynchosia volubilis with Hericium erinaceum mycelia (content: μg/g)
    1)Sample: RV-A; non-fermented R. volubilis, RVHE-A; fermented R. volubilis with H. erinaceum mycelia, RV-B; non-fermented R. volubilis-added herbs, RVHE-B; fermented R. volubilis-added herbs with H. erinaceum mycelia.
    Antioxidant component analysis of solvent extract from fermented Rhynchosia volubilis with Hericium erinaceum mycelia
    1)Solvent extract: RV-A-HW & -E; hot-water and EtOH extract from non-fermented R. volubilis, RVHE-A-HW & -E; hot-water and EtOH extract from fermented R. volubilis with H. erinaceum mycelia, RV-B-HW & -E; hot-water and EtOH extract from non-fermented R. volubilis-added herbs, RVHE-B-HW & -E; hot-water and EtOH extract from fermented R. volubilis-added herbs with H. erinaceum mycelia.
    2)Content: mg QE/g; mg quercetin equivalent/extract g, mg GAE/g; mg gallic acid equivalent/extract g.
    3)The difference in the superscript letter (small letter; flavonoid, capital letter; polyphenol) of the content value means a significant difference at p<0.05.
    Radical scavenging activity of solvent extract from fermented Rhynchosia volubilis with Hericium erinaceum mycelia
    1)Solvent extract: refer to Table 1.
    2)Radical scavenging activity: mg AEAC/g; mg ascorbic acid equivalent antioxidant capacity/extract g.
    3)The difference in the superscript letter (small letter; ABTS, capital letter; DPPH) of the content value means a significant difference at p<0.05.

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