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ISSN : 1225-4339(Print)
ISSN : 2287-4992(Online)
The Korean Journal of Food And Nutrition Vol.30 No.6 pp.1279-1285
DOI : https://doi.org/10.9799/ksfan.2017.30.6.1279

Protective Effect of PineXol® against Amyloid-β-induced Cell Death

Kyung-Hoon Han, Seung-Hee Lee, Kwang-Sung Park, Kwan-Young Song*, Jung-Hee Kim*, Eun-Kuk Park**, Sung-Hee Han***
Research Institute, Seoul Medical Center, Seoul 02053, Korea
*Dept. of Neurosurgery, Seoul Medical Center, Seoul 02053, Korea
**Dept. of Medical Genetics, Ajou University School of Medicine, Suwon 16499, Korea
***BK21Plus, College of Health Science, Korea University, Seoul 02841, Korea
Corresponding author : Sung-Hee Han, BK21Plus, College of Health Science, Korea University, Seoul 02841, Korea. +82-2-940-2764, sungheeh3@gmail.com
20170915 20171102 20171107

Abstract

Amyloid-β protein (Aβ) is known to increase free radical production in neuronal cells, leading to cell death by oxidative stress. The purpose of this study was to evaluate the protective effects of PineXol® on Aβ25-35 induced neuronal cell death. Rat pheochromocytoma (PC-12) cells were pre-treated with 100 μg/mL of PineXol® for 2 h. The cells were exposed to single dose of 30 μM Aβ25-35 for 24 h. Cell death was assessed by a cell count kit-8 (CCK-8) assay, lactate and dehydrogenase (LDH) release assay. An Apoptotic process was analyzed by a protein expression of the Bcl-2 family using western blotting. Cell viability increased in PC-12 cells treated with both Aβ25-35 and PineXol®, compared to the control group. PineXol® induced a decrease of the Bcl-2 protein expression (p<0.05), while Bax and Sod1 increased (p<0.05), indicating attenuation of Aβ25-35 induced apoptosis. These results suggest that PineXol® may be a good candidate for the prevention of Alzheimer’s disease(AD).


아밀로이드 베타로 유도된 신경세포 사멸에 대한 PineXol®의 보호효과

한경훈, 이 승희, 박 광성, 송 관영*, 김 정희*, 박 은국**, 한 성희***
서울의료원 의학연구소
*서울의료원 신경외과
**아주대학교 의과대학 의학유전학과
***고려대학교 보건과학대학 BK21Plus 보건과학사업단

초록


    서 론

    의학의 발달로 인하여 전 세계적으로 고령화 사회가 되어 가고 있으며, 한국도 2014년 노인인구 비율이 전체 인구의 약 12%를 차지하는 고령화 사회로 진입하게 되었다(Statistics Korea 2014). 노인인구의 증가로 인하여 노인질환의 대표적 인 퇴행성 질환인 노인성 치매(Alzheimer’s Disease: AD)의 발 생이 급증하고 있다(Korean Neurological Association 2012). 알 츠하이머병의 경우 85세 이상의 노인에게서 40~50%가 발병 하며, 미국의 알츠하이머병 환자가 400만 명, 우리나라에서 는 약 30만 명에 이르고 있고, 현재 우리나라 단위발생 사망 률에 있어서 악성종양과 심뇌혈관 질환 다음으로 알츠하이 머병이 큰 비중을 차지하고 있어서 점차 큰 사회적 문제로 인 식되고 있다(Geldmacher & Whitehouse 1996; Mayeux & Sano 1999).

    이렇게 사회적 문제가 되고 있는 알츠하이머병은 신경세포 손상 및 사멸로 인하여 뇌조직의 부피와 뇌활동의 감소 등의 특징을 보이고, 증상으로는 기억력, 언어능력 및 행동능력의 지속적인 감퇴 현상을 나타낸다(Hofman 1997 등). 이는 노화 와 밀접하게 관련된 것으로 알려져 있으며(Han 2009), 전체 질환 중 65세 이상의 노인에서는 대부분이 sporadic type으로 알려져 있다(Corder 1993 등; Strittmatter 1993등). 알츠하이머 병 환자의 사후 뇌조직에서는 세포 밖에서 분비된 베타 아밀 로이드(Aβ)가 신경세포 바깥에서 응집되는 노인반(neuritic or senile plaques)과 tau 단백질의 과인산화에 의하여 형성되는 신경섬유다발(neurofibrillary tangles)이 나타나는 것으로 확인 되었다(Soto 1994 등; Forloni 1996 등; Selkoe 1996).

    알츠하이머병 원인의 하나로는 Aβ의 생성, 세포 내 축적 및 독성을 유발하는 아밀로이드 전구 단백질(Amyloid Precursor Protein: APP)의 대사 이상으로 나타나는 것으로 알려져 있다. Aβ는 APP 아미노 말단을 절단하는 β-secretase와 카르복시 말 단을 절단하는 γ-secretase에 의해서 분해되어 생성된다. 이렇 게 생성된 Aβ는 38개에서 43개의 아미노산으로 이루어져 있고, 신경세포에 독성을 끼치는 것은 42개의 펩타이드로 알 려져 있다(Lorenzo and Yankner 1996 등; Pike 1997 등). Aβ가 과잉 생성, 응집되면 불용성 아밀로이드 덩어리를 형성하게 되며, 주변 신경세포에 염증반응을 일으키게 된다. 이로 인하 여 신경세포의 소실을 가져오게 되어 알츠하이머 병을 일으키 게 된다(Vassar 1999 등; Kayed 2003 등; Heneka 2015 등). 이 에 따라 많은 연구자들은 알츠하이머병의 지연 및 억제를 위한 치료법을 연구하고 있다. 미국 FDA 승인을 받아 사용 중인 치료제로는 리바스티그민(rivastigmine), 갈란타민(galanthamine), 도네페질(donepezil)이 있으며, 이는 모두 AChE 억제제로 알츠하이머병 치료제로서의 약물 효과를 인정받았 으나(Cummings 2014 등), 병의 근본적인 진행을 막지 못하고, 소화계 계통의 부작용이 있는 것으로 알려져 있다. 이에 최근 에는 알츠하이머병의 치료제를 천연물 소재로부터 개발하고 자 하는 연구가 많이 이루어졌으며, 그 결과, 은행나무, 강황, 은행잎 추출물, 그리고 인삼 등이 신경세포 생존을 증가시키 거나, 알츠하이머병의 진행을 늦출 수 있는 것으로 알려졌다 (Oken 1998 등; Bastianetto 2000 등; Park and Kim 2002; Wang 2016 등).

    프랑스 해송 추출물인 피크노제놀(pycnogenol®)은 폴리페 놀 성분을 많이 함유하고 있어서 항염, 항비만, 항산화 등에 효과적이라고 보고되었고(Rohdewald P 2002), 국내에서도 오래 전부터 소나무 수피는 민간요법으로 관절염, 화상, 지혈 등에 사용되었다(Kim 1999 등). 따라서 적송제제인 PineXol® 에 대한 성분 분석과 신경세포에 과산화수소 처리 후 항산화 효과에 대한 연구보고가 있지만, 알츠하이머병과 같은 퇴행 성 신경질환의 예방이나 억제에 대한 연구는 미비한 실정이 다(Hong 2016 등; Hwang 2016 등).

    따라서 본 연구에서는 국내 적송에서 추출한 PineXol®을 이용하여 Aβ25-35에 노출된 PC-12 신경세포에서 세포독성과 단백질 발현을 확인함으로써 퇴행성 질환의 억제 활성을 구 명하고자 하였다.

    재료 및 방법

    1.세포배양

    본 연구에 사용된 PC-12 신경세포는 백서의 부신피질 크 롬친화성 세포종(pheochromocytoma)으로부터 유래한 세포 주로서 한국세포주은행에서 구입하였으며, 콜라겐(collagen) 을 코팅한 100mm dish와 96 well plate에 DMEM 배지(Gibco, Grand Island, NY)에 10% FBS (Fetal bovine serum)와 1% penicillin과 streptomycin를 첨가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에 서 배양하였다. 본 연구에서는 아밀로이드 베타 단백질(Aβ25-35, 30 μM)을 처리하기 2시간 전에 1% FBS가 들어있는 DMEM 배양액으로 교환하였다.

    2.실험재료

    25-35는 TOCRIS bioscience(Bristol, UK)에서 구입하였고, PBS에 용해시킨 후 0.2 μm 실린지 필터를 이용하여 여과하 였으며, Aβ25-35를 세포실험에 사용하기 전 37℃에서 1주일간 aging 단계를 거친 후 사용하였다. PineXol®은 뉴트라팜(주) (NutraPharm Co., LTD, Gangneung, S. Korea)로부터 제공받아 사용하였으며, Aβ25-35 처리 2시간 전 각각의 농도에 따라서 3차 증류수에 희석한 후, 0.2 μm 실린지 필터를 이용하여 여 과 후 사용하였다.

    3.총 폴리페놀 및 플라보이노이드 함량 측정

    PineXol®의 총 폴리페놀 함량의 측정은 Folin-Ciocalteu method(Maksimović 2005 등)의 방법을 변형하여 측정하였다. PineXol® 10 mg/mL의 농도로 제조한 시료 증류수 790 mL와 0.9 N Folin-Ciocalteu 시약 50 mL를 넣고 잘 혼합시킨 후, 20% sodium carbonate solution 150 mL를 첨가하여 암실에서 2시간 동안 반응시킨 후 흡광도(750 nm)를 측정하였다. 총 폴리페 놀 함량은 gallic acid를 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 함량을 구하였다. PineXol®의 총 플라보노이드 함량의 측정 은 p-dimethylaminocinnamaldehyde(DMACA) 방법(Drosou 2015 등)을 변형하여 측정하였다. 즉, PineXol® 10 mg/mL의 농도로 제조한 시료 10 mL에 DMACA 시약 200 mL를 첨가하고, 잘 혼합하여 실온에서 10분간 반응시켰다. 반응이 완료된 시료 의 흡광도를 640 nm에서 측정하였고, 총 플라보노이드 함량 분석은 카테킨(catechin)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부 터 구하였다.

    4.세포 생존율 측정

    25-35 처리에 따른 PC-12 신경세포의 세포 생존율을 측정 하기 위해서 96-well plate에 8×103 cells/well의 농도로 각각 세 포를 분주한 후, Aβ25-35 의 농도가 10, 20, 30, 40, 그리고 50 μM인 배양액에서 24시간동안 배양하였다. 24시간 배양된 후 CCK-8 assay kit 용액을 첨가하고, 2시간 후 microplate reader 를 사용하여 흡광도(450 nm)를 측정하였으며, 측정된 값은 비처리군 값과 비교하여 백분율(%)로 표시하였다.

    5.Lactate dehydrogenase (LDH) 측정

    PC-12 신경세포에 PineXol®을 2시간동안 전처리시킨 후 A β25-35를 30 μM의 농도로 처리하여 24시간 배양한 후, Cytotoxicity LDH assay kit(Dojindo Co., LTD, Japen)를 사용하여 흡광도(490 nm)를 측정한 후 세포막 손상을 확인하였다.

    6.Western blot 분석

    PC-12 신경세포에 PineXol®과 Aβ25-35을 24시간 동안 배양 한 후, 배양액을 걷어내고 DPBS로 2회 세척을 하였으며, 단 백질 추출액을 첨가한 후, 4℃에서 30분 동안 처리하였다. 이 후 추출된 단백질은 SDS-PAGE 전기영동을 실시하였으 며, PVDF membrane에 전이시켰다. 그 다음 5% fat-free milk 로 전처리하고, 목적 단백질에 대한 1차 항체(anti-Bcl-2, anti- Bax, anti-SOD-1)를 처리한 다음 2차 항체를 처리 후, ECL western blotting detection reagent(iNtRON Biotechinology Co., Ltd, Korea)를 이용하여 목적 단백질을 검출하였다. Western blot의 밴드는 Bio-1D(VILBER Lourmat SAS, Marne-la-Vallée., France)를 이용하여 관찰하였다.

    7.통계처리

    모든 실험 결과는 각 항목에 따라 평균±표준편차로 표시 하였다. 통계적 분석은 SPSS 20.0 K를 이용하여 one way ANOVA를 시행하였으며, p<0.05의 경우를 통계적으로 유의 한 것으로 판정하였다.

    결과 및 고찰

    1.총 폴리페놀 및 플라보노이드 함량

    본 연구에 사용된 PineXol®의 총 폴리페놀과 플라보노이드 의 함량은 각각 829.84±5.36 GAE mg/g과 86.71±0.44 CAT mg/g으로 확인되었다(Table 1). 이는 Lee 등(2013)이 발표한 PineXol®에서의 총 폴리페놀과 플라보노이드의 결과 값인 717.40±6.86 GAE mg/g과 54.44±0.01 RE mg/g보다 높으며, Ku 등(2007)이 발표한 해송 껍질 추출물인 pycnogenol에서의 총 폴리페놀 값인 541 GAE mg/g보다 본 연구에 사용된 PineXol® 의 총 폴리페놀 값이 높은 것을 확인하였다. 이에 PineXol®이 가진 페놀성 화합물로 인하여 Aβ25-35에 처리에 따른 세포 독 성에 보호효과가 있을 것으로 기대된다.

    2.PineXol®이 PC-12 신경세포의 생존에 미치는 영향

    PC-12 신경세포에서 Aβ25-35의 세포독성을 억제하는 PineXol® 의 보호 효과를 측정하기 전 PineXol®의 PC-12 신경세포에서 의 세포 독성을 알아보기 위해서 CCK-8 assay를 수행한 결과 는 Fig. 1과 같다. PineXol® 농도 100~1,000 μg/mL에서 세포 생존율을 확인해 본 결과, 200 μg/mL에서부터 PC-12 신경세 포의 생존율이 대조군과 비교 시 유의적으로 감소하는 것을 관찰할 수 있었으며(p<0.05), 1,000 μg/mL의 농도에서는 세포 생존율이 42%까지 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이에 본 연구에서는 PC-12 신경세포의 생존에 영향을 끼치지 않는 100 μg/mL의 농도에서 실험에 사용하였다.

    3.Aβ25-35의 처리에 따른 PC-12 신경세포의 세포 사멸

    백서의 부신피질 크롬친화성 세포종(pheochromocytoma)인 PC-12 신경세포에서 알츠하이머병의 원인으로 알려진 신경 독소 단백질인 Aβ에 의한 세포 독성을 알아보고자 하였다. 최근 연구 결과에 의하면 Aβ는 in vitroin vivo 상에서 신경 독성을 가지고 있는 것으로 확인되었으며(Yankner 1990 등; Behl 1994 등; Shearman 1994 등), 합성된 Aβ1-40, Aβ25-35 또한 여러 신경세포에서 독성을 나타내는 것으로 보고되었다 (Kowall 1991 등). 본 실험에서 사용한 Aβ25-35를 PC-12 신경 세포에 24시간 처리 후 CCK-8을 측정한 결과는 Fig. 2와 같으 며, 본 연구에서는 Aβ25-35 30 μM의 농도로 PC-12 신경세포에 처리하였다.

    4.Aβ 유도된 PC-12 신경세포 독성에 대한 PineXol®의 보호효과

    25-35 처리에 따른 PineXol®의 보호효과를 확인하기 위하 여, Aβ25-35 30 μM의 처리하기 2시간 전 PineXol® 100 μg/mL 를 처리하였으며, 이 후 Aβ25-35 30 μM을 24시간 처리 후 CCK-8 assay을 이용하여 측정한 결과는 Fig. 3과 같다. 그 결 과, PineXol® 전처리군의 경우, PC-12 세포사를 Aβ25-35 처리 군과 비교 시 27% 가량 유의적으로 감소시키는 것을 확인할 수 있었다(p<0.05).

    5.Aβ 유도된 PC-12 신경세포의 형태학적 관찰

    25-35 처리에 의한 PC-12 신경 세포사의 양상을 규명하기 위해 광학 현미경을 통해 세포의 외형적 변화와 핵 형태의 변화를 관찰하였다(Fig. 4). 광학 현미경을 이용하여 세포외 형의 변화를 Aβ25-35 처리 24시간 후에 관찰한 결과, Aβ25-35 30 μM을 처리한 경우, 대조군(Fig. 4ⓐ)에 비해 세포체의 응 축과 불절 및 신경돌기의 소실 등의 전형적인 세포자멸사 (apoptosis) 형태의 세포사를 나타내었다(Fig. 4ⓒ). 이는 Aβ25-35 에 의한 PC-12 신경 세포의 세포사가 세포자멸사로 나타 나는 것을 확인할 수 있었으며, PineXol® 전처리군의 경우(Fig. 4ⓓ), 대조군과 비교 시 세포의 형태학적 변화가 없는 확인할 수 있었다.

    6.Lactate dehydrogenase (LDH) 측정

    PineXol® 전 처리에 따른 PC-12 신경세포에서 세포막 보호 효과를 확인하였다. 뇌는 세포 내 지질 함량이 높고, 체내에 서 가장 많은 활성산소를 생성함으로써 산화 스트레스에 의 해서 쉽게 파괴되는 구조를 가지고 있다(Lenaz 등 1998). 이 에 본 연구에서 PC-12 신경세포의 신경세포질 성분인 Lactate dehydrogenase(LDH)의 방출량을 측정한 결과는 Fig. 5와 같 다. Aβ25-35 처리 시 대조군과 비교하여 LDH 방출량이 유의 적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었으며, PineXol® 100 mg/mL 전처리군의 경우, LDH의 방출량이 대조군보다 높게 측정되었지만, Aβ25-35 처리군보다 낮은 것을 확인할 수 있었 다(p<0.05).

    7.Bcl family 단백질 분석

    25-35의 세포독성으로 인하여 PC-12 세포 내 다양한 신호 전달이 활성화되는데, 세포자멸사에서 중요한 역할을 하는 Bcl-2 family 단백질의 발현을 Western blot을 통하여 확인하 였다(Fig. 6ⓐ). 세포 자멸사를 억제하는 Bcl-2 단백질 발현 은 대조군과 비교 시 Aβ25-35 처리군에서 감소를 보였으며, PineXol® 전처리군에서는 증가하는 것을 확인할 수 있었다 (Fig. 6ⓑ). 더욱이 세포자멸사를 촉진시키는 Bax 단백질의 경우, PineXol® 전처리군이 Aβ25-35처리군보다 감소하는 것을 확인할 수 있었으며 (Fig. 6ⓒ), 체내 활성 산소를 제거한다고 알려진 sod-1 단백질의 경우, PineXol® 전처리군이 Aβ25-35처 리군보다 높은 단백질 발현 양상을 보였다(Fig. 6ⓓ). 이는 PineXol®이 가진 생리활성 물질들로 인하여 Aβ25-35 유도된 세포자멸사를 억제하는 것으로 사료된다.

    요약 및 결론

    본 연구에서는 PineXol®이 신경보호 효과가 있다는 선행 연구결과를 토대로, 백서의 부신피질 크롬친화성 세포종인 PC-12 신경세포에서 Aβ25-35로 유도된 세포자멸사를 통하여 PineXol®의 보호효과를 알아보고자 하였다. PC-12 신경세포 에서 세포자멸사를 유도하기 위해 aging된 Aβ25-35 30 μM을 24시간 처리한 결과, 세포 생존율에서 대조군과 유의적인 감 소가 나타나는 것을 CCK-8 assay를 통하여 확인하였으며, PineXol® 100 μg/mL 전처리군이 Aβ25-35처리군보다 세포 생존 율에서 유의적으로 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 세포 의 형태학적 관찰 결과, PineXol®을 전처리군에서는 Aβ25-35처 리군에서 나타나는 세포의 모습인 신경돌기의 소실이 나타 나지 않은 것을 확인할 수 있었다. 또한, PineXol® 전처리군이 Aβ25-35처리군보다 LDH 방출량이 유의적으로 낮은 것으로 확 인되었으며, 이는 Aβ25-35에 의해 유발된 신경세포막 손상으 로부터 PineXol®이 가지고 있는 생리활성 물질들로 인해서 세포막 보호효과를 가졌을 것으로 사료된다. 단백질 발현을 확인해본 결과, PineXol® 전처리군이 Aβ25-35처리군보다 Bcl2 단백질의 발현은 높았으며, Bax의 단백질 발현은 보다 낮게 나타났다. 특히 항산화와 관련 단백질인 Sod-1 단백질의 발 현이 높은 것으로 확인됨으로써, PineXol®이 가진 활성물질 들로 인하여 Aβ25-35 신경 독성 물질로부터 신경세포의 손상 을 억제하고, 신경세포를 보호하는 효과가 있다는 것을 확인 할 수 있었다. 이와 같은 결과로 볼 때, 신경질환의 약용 후보 물질로서 PineXol®의 유용한 가능성을 제시할 수 있다고 판 단된다.

    감사의 글

    이 논문은 2017년도 서울시 재원으로 보조금 지원을 받아 수행된 2017년 “아밀로이드베타로 유도된 신경세포 독성에 대한 파인엑솔의 보호효과”의 연구비로 연구되었으며, 이에 감사드립니다.

    Figure

    KSFAN-30-1279_F1.gif
    Concentration dependent effects of PineXol® on PC-12 cell viability.

    Cells were treated with various concentrations (100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, and 1,000 μg/mL) of PineXol® and cell viability were measured by CCK-8 assay. The data shown are means±S.D. * Statistical significant difference between groups (p<0.05).

    KSFAN-30-1279_F2.gif
    Concentration dependent effects of Aβ25-35 on PC- 12 cell viability.

    Cells were treated with various concentrations (10, 20, 30, 40, and 50 μM) of Aβ25-35 and cell viability was measured by CCK-8 assay. The data shown are means±S.D. * Statistical significant difference between groups (p<0.05).

    KSFAN-30-1279_F3.gif
    Neuroprotective effects of PineXol®.

    PC-12 cell was pretreated for 2 h with various concentrations of Pine- Xol®. The cells were then treated with 30 μM Aβ25-35 for 24 h. The cell viability was measured by CCK-8 assay. The data shown are means±S.D. * Statistical significant difference between groups (p<0.05).

    KSFAN-30-1279_F4.gif
    Neuroprotective effects of PineXol® against Aβ25-35 induced apoptosis of PC-12 cells.

    The cells were exposed to single dose of 30 μM Aβ25-35 and morphological changes were monitored for 24 h (ⓐ: control×10, ⓑ: 100 μg/mL PineXol® ×10, ⓒ: 30 μM Aβ25-35×10, ⓓ: Aβ25-35 30 μM+PineXol® 100 μg/mL×10).

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    Effects of PineXol® against Aβ25-35 induced cell membrane toxicity in PC-12 cells.

    The cells were pretreated for 2 h with 30 μM of PineXol® and then treated with 30 μM of Aβ25-35 for 24 h. The inhibition effect of LDH release on Aβ25-35 induced cell was measured by cell membrane toxicity assay kit. The data shown are means±S.D. * Statistical significant difference between groups (p<0.05).

    KSFAN-30-1279_F6.gif
    Immunoreactivity of Bcl-2, Bax and Sod-1 in PC-12 cells.

    Cells were pre-incubated with PineXol® for 2 h and then exposed to Aβ25-35 (30 μM) for additional 24 h. and protein samples were prepared for Western blot analysis (A). Protein expression of Anti-apoptotic Bcl-2 (B), Pro-apoptotic Bax (C), and Sod-1 (D) were compared by Western blot analysis. The data shown are means±S.D. * Statistical significant difference between groups (p<0.05).

    Table

    Total polyphenolic and flavonoid contents of PineXol®
    All values are mean±S.D. of triplicate determination.
    1)Gallic acid equivalent.
    2)Catechin equivalent.

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