서 론

한국, 일본, 중국 등에 자생하는 침엽수의 대표종인 소나 무(Pinus densiflora Sieb. et Zucc)는 소나무과(Pinaceae)의 상 록침엽 교목으로 두 잎이 뭉쳐나고 피침모양이며, 예로부터 건강식품으로 많이 이용되어 왔다(Kim 등 2012). 소나무는 순, 줄기, 가지, 잎, 그리고 꽃가루가 식용원료로 사용 가능하 며, 솔방울은 식품원료로 고시는 되어 있지 않으나, 한방에서 는 약용으로 사용되고 있으며, 민가에서는 당 또는 알코올로 추출하여 많이 식용하고 있다(MFDS 2017). 소나무의 유효성 분에 관한 연구는 비교적 활발히 진행되어 왔으며(Cho EM 2007; Jang 등 2008), 프랑스 해안지방의 소나무를 추출하여 만든 천연 항산화제 피크노제놀(pycnogenol)은 국제적으로 판매되고 있는 등, 앞으로 다양한 소나무 추출물을 이용한 제 품이 개발될 것으로 기대된다(Cho 등 2010).

소나무의 정유성분으로는 terpenoid, phenol, tannin, alkaloid, flavonoid 등이 존재하며(Koukos 등 2000), 특히 이들 중 피톤 치드 성분은 항균 및 방충효과가 뛰어나, 양상추의 저장연 장 효과(Kim 등 2013), 집먼지 진드기 기피효과(Hong & Jee 2009), 구강병원균에 대한 항균작용(Kim 등 2007) 등의 효과 가 있고, 인체의 생리대사에도 영향을 주는 것으로 보고되었 다(Lee & Lee 2012).

소나무에는 솔잎의 항산화 효과(Jang 등 2008), 항비만(Jeon 등 2005), 면역 활성 증진(Cho EM 2007) 등 다양한 생리활성 이 보고되었으며, 특히 병원성, 식중독 유발 미생물에 대한 항균효과(Kim YS & Shin 2005)에 관한 연구도 보고된 바 있 다. 솔잎 외 부위에 대한 연구로는 솔순의 열수 및 에탄올 추 출물의 생리활성(Cho 등 2009)이 보고되었으며, 솔방울의 항 균성에 관한 연구(Velmurugan 등 2015)가 진행된 바 있으나, 솔잎에 비해 연구가 상당히 부족한 실정이다.

따라서 본 연구에서는 국내에 자생하는 소나무의 새순과 솔방울의 성분특성과 항산화효과를 알아보고 솔잎뿐만 아니 라, 소나무 순과 솔방울을 식의약용 원료로서 활용할 수 있는 방법을 모색하고자 하였다.

재료 및 방법

1.공시재료

본 연구에 사용한 소나무는 2015년 6월에 충북 증평군 일 대 야산에서 자생하는 소나무에서 솔순과 어린 솔방울, 솔잎 을 채취한 후 세척하여 순은 2 cm 길이로, 솔방울은 1 cm 크 기로 세절하고, 솔잎은 원물 상태로 40℃에서 3일간 열풍건 조한 후 분쇄하여 시료로 사용하였다.

2.추출물 제조

소나무 추출물 제조는 건조 시료 50 g에 증류수 1,000 mL 를 첨가한 후, 90℃에서 3시간 환류냉각 추출하였으며, 에탄 올 추출물은 시료 50 g에 70% 에탄올 500 mL를 첨가한 후, 상온에서 24시간 교반하여 추출한 후 잔사에 다시 500 mL의 70% 에탄올을 첨가하여 2회 반복 추출하였다. 이후 두 종류 의 추출물 모두 여과지(No.2, Advantec, Tokyo, Japan)로 여과 한 후, Rotari evaporator(N-1000, EYELA, Tokyo, Japan)로 농 축한 후 동결건조하여 측정 시료로 사용하였다.

3.Total polyphenol 함량 측정

부위별 소나무 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Denis법 (Gutfinger T 1981)을 변형하여, 추출물 1.0 mL에 1.0 N Folin- Ciocalteau 시약 및 20% Na₂CO₃ 용액을 각 1.0 mL씩 차례로 가한 다음 실온에서 30 분 정치한 후 UV-Vis Spectrophotometer (UV-2450, SHIMADZU, Kyoto, Japan)를 이용하여 765 nm에 서 흡광도를 측정하였다. Gallic acid(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)를 0~200 μg/mL의 농도로 제조하여 시료와 동일한 방법으로 분석하여 얻은 표준 검량선으로부터 시료 추출물의 총 페놀 함량을 산출하였고, gallic acid equivalents (mg GAE/g extract)로 나타내었다.

4.Total flavonoid 함량 측정

총 플라보노이드 함량은 Jia 등(1999)의 방법을 변형하여 측정하였다. 즉, 시료액 250 μL에 5% NaNO₂ 75 μL를 첨가하 여 상온에서 5분간 반응시킨 후에 10% AlCl₃ 150 μL를 첨가 하였다. 이 용액에 1 M NaOH 0.5 mL와 증류수 275 μL를 첨 가한 후에 UV-Vis Spectrophotometer로 510 nm에서 흡광도를 측정하였으며, catechin을 표준물질로 하여 0~1 mg/mL의 농 도 범위에서 얻어진 표준 검량선으로부터 추출물의 총 플라 보노이드 함량을 계산하였다.

5.DPPH 라디칼 소거능 측정

추출물의 DPPH 자유라디칼에 대한 환원력 측정은 Blois (1958)의 방법에 따라 측정하였다. 에탄올에 녹인 0.2 mM DPPH(1,1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)용액 0.8 mL에 희석한 시료 0.2 mL를 혼합하여 15분간 반응 후, UV-Vis Spectrophotometer로 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 양성대조군으로 항산화제 인 butylated hydroxyanisole(BHA) (Sigma, St. Louis, MO, USA) 를 사용하였다. 각 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성(EDA)은 다음과 같이 나타내었다.

EDA (%) = ( Blank O.D.-Sample O.D. ) Blank O.D. ×100

6.Reducing power 측정

Reducing power 측정을 위하여 희석한 추출물 0.5 mL에 0.2 mM phosphate buffer (pH 6.6) 2.5 mL와 1% potassium ferricyanide 2.5 mL를 첨가하여 교반한 후 50℃에서 20분간 반응시켰다. 이후 10% trichloroacetic acid를 2.5 mL를 가한 다 음 2,000×g에서 10분간 원심분리한 후 상등액 2.5 mL와 증류 수 2.5 mL, 0.1% ferric chloride 0.5 mL를 첨가하여 혼합한 후 UV-Vis Spectrophotometer를 이용하여 700 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이후 측정값을 최대 환원력에 대한 추출물의 환 원력으로 나타내었다.

RP (%) = Sample O.D. Max O.D. ×100

7.ABTS를 이용한 총 항산화력 측정

ABTS[2,2ʹ-azinobis-(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 라디칼을 이용한 항산화력의 측정은 Erkan 등(2008)의 방법 을 변형하여 사용하였다. 7 mM ABTS 용액과 2.45 mM potassium persulfate를 암실에서 12~16시간 동안 반응시켰다. 이 를 734 nm에서 흡광도가 1.5가 되도록 증류수로 조정한 후 200 μL를 취하고, 샘플 20 μL를 가하여 실온에서 10분간 반응 시켜 UV-Vis Spectrophotometer를 이용하여 734 nm에서 흡 광도를 측정하였다. 각 시료의 총 항산화력은 TEAC(Trolox equivalent antioxidant capacity)로 나타내었다.

8.FRAP를 이용한 총 항산화력 측정

FRAP(ferric reducing antioxidant power) 측정을 위해서 300 mM acetate buffer(pH 3.6), 40 mM HCl에 용해한 10 mM TPTZ 및 20 mM FeCl₃․6H₂O를 각각 10:1:1(v/v/v)의 비율로 혼합하 여 FRAP 시약을 제조하였다. 이어서 여러가지 농도의 시료 액 0.15 mL와 3.0 mL의 FRAP 시약을 혼합하고, 37℃에서 5 분간 반응시킨 후, UV-Vis Spectrophotometer로 593 nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과는 FeSO₄․7H₂O를 표준물질로 환 산하여 FRAP value(mM FeSO₄ eq./mg extract)로 나타내었다.

9.통계처리

모든 실험은 3회 이상 반복 측정하여 평균과 표준편차로 나타내었으며, 각 군간 유의성 검증은 IBM SPSS Statistics 20 (IBM Corp., Armonk, NY, USA)을 이용하여 one-way ANOVA 검정을 시행하여 유의성이 나타난 경우, 유의성 비교는 Duncan's 다중범위 검정법(p<0.05)을 실시하였으며, 단순상관분 석을 실시하였다.

결과 및 고찰

1.추출수율

솔순, 솔방울 및 솔잎의 물 추출물과 에탄올 추출물의 추 출수율은 Table 1에 나타내었다. 솔순의 추출수율은 물과 에 탄올 추출물이 각각 25.5±0.5, 27.9±0.3%로 나타났으며, 솔방 울의 물, 에탄올추출물은 각각 16.9±0.3%와 21.5±0.4%로 나 타나, 에탄올 추출이 물추출보다 수율면에서 유리한 것으로 확인되었다. 솔잎의 경우는 물 추출물(16.1±0.3%)이 에탄올 추 출물(15.4±0.5%)에 비해 수율이 높은 것으로 나타났다. 솔잎 추출물의 수율은 건조방법에 따라서도 다르게 나타나는데, 진공건조 시료가 가장 높고, 열풍건조와 동결건조 순으로 보 고된 바 있다(Chung 등 2013). 본 연구에서는 열풍건조방식을 이용하였으며, 추출수율 향상을 위하여 향후 에탄올 농도와 건조방법을 달리한 추출물의 수율을 확인할 필요가 있을 것 으로 사료된다.

2.총 폴리페놀 함량

솔순, 솔방울 및 솔잎의 물 추출물과 에탄올 추출물의 총 폴리페놀 함량은 Fig. 1에 나타내었다. 총 폴리페놀 함량은 솔방울 에탄올 추출물이 232.99±0.18 mg GAE/g extract로 가 장 높았으며, 솔방울 물 추출물(185.24±0.18 mg GAE/g extract), 솔잎 물 추출물(57.20±0.21 mg GAE/g extract)의 순으로 확인 되었다. 물과 에탄올 추출물 모두에서 솔방울 추출물이 솔순, 솔잎 추출물보다 약 5배 높은 것으로 나타나, 솔순과 솔잎보 다는 솔방울에서 높은 항산화 작용을 기대할 수 있을 것으로 판단되었다. 폴리페놀 화합물은 식물계에 널리 분포되어 있 는 2차 대사산물로서 일반적으로 항산화 작용이 강한 것으로 밝혀져 있으므로, 총 폴리페놀 함량의 분석은 중요한 의미를 가진다(Cho 등 2010). Jeong 등(2014)은 미성숙 솔방울의 열 수추출물의 폴리페놀 함량이 14 mg/g이라 보고하였고, Cho 등(2009, 2010)은 각각 솔순 물 추출물과 에탄올 추출물의 폴 리페놀 함량이 30.7 mg/g, 151.0 mg/g으로 에탄올 추출물에서 5배 정도 높게 나타났다고 보고하여 본 연구와는 다소 차이 가 있는 것으로 나타났는데, 이는 시료의 채취시기와 지역의 고도 및 온도 등의 차이에 기인하는 것으로 판단되며, 향후 이를 고려한 표준화 연구가 이루어져야 할 것으로 사료된다. Cheong 등(2013)은 잣솔잎의 건조방법에 따라 폴리페놀 함 량이 다르며, 552.2~669.1 mg% 범위 내에 있다고 보고한 바 있다.

3.총 플라보노이드 함량

솔순, 솔방울, 솔잎의 총 플라보노이드 함량은 Fig. 2에 나 타내었다. 플라보노이드 함량도 총 폴리페놀 함량과 유사한 경향을 나타내었으며, 모든 시료에서 폴리페놀 함량보다는 낮게 정량되었다. 즉, 솔방울 에탄올 추출물이 161.67±1.30 mg CE/g extract로 가장 높았으며, 솔방울 물 추출물(138.30±0.18 mg CE/g extract), 솔잎 물 추출물(19.16±1.01 mg CE/g extract) 의 순으로 확인되어 추출용매와 상관없이 솔방울 내에 플라 보노이드 함량이 8배 이상 압도적으로 높은 것으로 확인되었 다. 잣솔잎의 경우, 플라보노이드 함량은 폴리페놀 함량과 반 대의 경향을 나타내며, 열풍건조 시료에서 가장 높은 것으로 보고된 바 있다(Cheong 등 2013). 이러한 결과는 열풍건조된 방아풀의 총 플라보노이드 함량이 동결건조시료보다 1.5배 이상 높게 나온 것(Kim 등 2009)과 일치하는 경향이다.

4.DPPH 라디칼 소거능

솔순, 솔방울 및 솔잎의 물 추출물과 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성을 측정한 결과는 Fig. 3에 나타내었다. 추 출용매와 상관없이 솔방울의 DPPH 라디칼 소거활성이 솔순 과 솔방울에 비해 3~5배 정도 높은 것으로 나타났으며, 솔방 울의 경우, 에탄올 추출물이 물 추출물보다 좀 더 높은 것으 로 확인되었다. Cho 등(2009, 2010)은 각각 솔순 물 추출물과 에탄올 추출물의 DPPH 라디칼 소거활성이 40.5, 88.9%(1 mg/mL)로 에탄올 추출물이 높다고 하여 본 연구결과와 유사 한 경향을 보고한 바 있다. 반면, 솔잎과 솔순의 DPPH 라디 칼 소거활성은 물 추출물이 좀 더 높은 것으로 나타났다. 소 나무의 부위별 항산화활성을 비교한 보고는 찾아볼 수 없었 으며, Yoo 등(2004)은 솔잎 수용성 추출물의 DPPH radical 소 거능을 확인한 결과, 0.1%농도에서 70%로 나타났으며, 농도 의존적인 증가패턴을 보인다고 보고한 바 있다. 또한, Cheong 등(2013)은 잣솔잎의 전자공여능은 동결건조>진공건조>열풍 건조의 순으로 나타났다고 보고한 바 있다. 본 연구결과는 부 위별 항산화 활성을 비교한 것으로, 이 결과를 바탕으로 솔방 울의 추출조건과 농도를 달리하여 DPPH radical 소거능을 확 인하는 추가연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.

5.Reducing power

소나무 부위별 추출물의 Reducing power는 Fig. 4에 나타내 었다. 소나무 부위별 추출물의 reducing power는 DPPH 라디 칼 소거능과 유사한 경향을 나타냈는데, 폴리페놀과 플라보 노이드 함량과 상관성이 있는 것으로 사료된다. 즉, 추출용매 와 상관없이 솔방울의 환원력이 가장 높게 나타났으며, 솔방 울의 경우, 에탄올 추출물이 물 추출물에 비해 환원력이 높은 것으로 확인되었다. 솔순과 솔잎은 물 추출물이 에탄올 추출 물에 비해 환원력이 높게 나타났으며, 솔순보다는 솔잎의 환 원력이 좀더 높은 것으로 확인되었다. 대조구인 BHA와 비교 하였을 때 절반 정도에 해당하는 것으로 솔방울 추출물에서 환원성 물질이 항산화 활성에 다소 약하게 작용함을 추정할 수 있으며, 향후 농도별 환원력 측정실험이 추가로 진행되 어야 할 것으로 사료된다. 소나무 각 부위의 환원력에 대한 보고는 찾을 수 없었으며, Pak 등(2014)은 콜라비의 에탄올과 물 추출물의 환원력을 확인할 수 있었으나, ascorbic acid에 비 해서는 상당히 낮게 나왔다고 보고한 바 있다.

6.ABTS를 이용한 총 항산화력

솔순, 솔방울 및 솔잎의 물 추출물과 에탄올 추출물의 ABTS 라디칼 소거활성은 Fig. 5에 나타내었다. 솔방울의 에탄올과 물 추출물이 각각 1.721±0.004 mM과 1.493±0.004 mM으로 가 장 높게 나타났으며, 솔잎 물 추출물(0.503±0.003 mM)과 솔 순 물 추출물(0.432±0.002 mM) 순으로 나타나, 추출용매와 상관없이 솔방울의 ABTS 라디칼 소거활성이 가장 높은 것 으로 확인되었다. 소나무 부위별 ABTS를 이용한 항산화력 을 비교한 연구는 찾을 수 없었으며, 잣솔잎의 경우, 동결 건조방법의 ABTS radical 소거능이 열풍건조방법에 비해 높은 것으로 보고된바 있어, 솔방울도 건조방법을 달리한 ABTS radical 소거능 측정연구가 필요할 것으로 사료된다. 또 한, 솔방울 추출물의 항산화력은 합성 항산화제인 BHA의 TEAC(0.676±0.002 mM)와 비교하였을 때, 이 매우 높은 활성 을 나타내는 것으로 나타나, 이에 대한 추가 연구가 진행되어 야 할 것으로 사료된다.

7.FRAP를 이용한 총 항산화력

소나무 부위별 추출물의 FRAP value를 측정한 결과는 Fig. 6에 나타내었다. 솔순 물 추출물과 에탄올 추출물이 각각 0.624±0.041과 0.499±0.037 mM의 FRAP value를 나타내었으 며, 솔방울에서는 2.436±0.020, 2.772±0.019 mM, 솔잎에서는 0.779±0.031, 0.606±0.052 mM로 나타났다. 즉, 추출용매에 상 관없이 솔방울의 FRAP value가 가장 높았으며, 솔방울의 경 우는 에탄올 추출물의 FRAP value가 약간 더 높게 나타났다. 솔순과 솔잎의 경우, 물추출이 에탄올 추출물보다 약간 높은 FRAP value를 보였다. 이러한 경향은 총 폴리페놀 및 플라보 노이드 함량, DPPH radical 소거능, ABTS를 이용한 총 항산 화력과 유사하게 나타났다. FRAP법은 비교적 최근에 개발되 어진 방법으로 재현성이 높은 반면, 환원력을 가지지 않은 항 산화제에 대해서는 정확성이 떨어지는 것으로 알려져 있다 (Moon 등 2003). 따라서 본 연구에서 소나무 부위별 항산화 력을 비교하는 데는 빠르고 경제적인 측정방법으로 활용 가 능하며, 다른 항산화력 결과와 유사한 경향을 보이므로 측정 의 정확도는 높은 것으로 판단된다.

종합적으로 폴리페놀, 플라보노이드 함량, DPPH 라디칼 소거활성, Reducing power, ABTS를 이용한 총 항산화력 및 FRAP를 이용한 총 항산화력 등 모든 항산화 활성 측정에서 추출물에 관계없이 솔방울이 가장 높은 활성을 보였으며, 에 탄올 추출물이 물 추출물에 비해 약간 더 높은 활성을 보이는 것으로 확인되었다. 이 결과는 향후 솔방울의 기능성 식품첨 가물 또는 기능성 화장품으로 활용하기 위한 기초연구로써 의 미를 가질 것으로 기대되며, 향후 추출 시 에탄올 농도를 달 리한 솔방울의 항산화력 측정연구가 진행될 필요성이 있을 것으로 사료된다. 또한, 본 연구에서는 열풍건조시료를 사용 하였으며, 건조방법에 따라 결과가 다르게 나타난 보고들이 있어, 이에 대한 추가연구가 진행되어야 할 것으로 판단된다.

8.총 폴리페놀, 플라보노이드 함량과 항산화력과의 상관 관계

솔순, 솔방울 및 솔잎의 물 추출물과 에탄올 추출물의 총 폴리페놀, 플라보노이드 함량과 항산화력 사이의 상관관계를 확인한 결과는 Table 2에 나타내었다. DPPH 라디칼 소거능, Reducing power, ABTS 라디칼 소거활성, FRAP 값 모두 1% 유의수준에서 유의성이 있는 것으로 확인되었다. 따라서 소 나무 부위의 항산화 활성은 총 폴리페놀, 플라보노이드 함량 에 밀접한 영향을 받는 것으로 판단된다.

요약 및 결론

본 연구에서는 다양한 기능성을 가진 것으로 알려진 소나 무의 잎, 새순, 솔방울을 이용하여 항산화 활성을 측정하였 다. 솔순과 솔방울은 에탄올 추출이 물 추출보다 수율면에서 유리하였으며, 솔잎의 경우, 물 추출물이 에탄올 추출물에 비 해 높았다. 총 폴리페놀 함량은 솔방울 에탄올 추출물이 솔잎 과 솔순추출물에 비해 5배 정도 높았으며, 솔방울 물 추출물, 솔잎 물 추출물의 순으로 확인되었다. 플라보노이드 함량도 총 폴리페놀 함량과 유사한 경향을 나타내었다. 추출용매와 상관없이 솔방울 내에 플라보노이드 함량이 8배 이상 압도적 으로 높았다. 솔방울의 DPPH 라디칼 소거활성이 솔순과 솔 방울에 비해 3~5배 정도 높은 것으로 나타났으며, 에탄올 추 출물이 물 추출물보다 좀 더 높았다. Reducing power는 솔방 울의 환원력이 가장 높았으며, 에탄올 추출물이 물 추출물에 비해 높게 나타났다. ABTS 라디칼 소거활성과 FRAP value도 추출용매에 상관없이 솔방울에서 가장 높았으며, 에탄올 추 출물이 약간 더 높게 나타났다. 종합적으로 폴리페놀, 플라보 노이드 함량, DPPH 라디칼 소거활성, Reducing power, ABTS 를 이용한 총 항산화력 및 FRAP를 이용한 총 항산화력 등 모든 항산화 활성 측정에서 솔방울이 가장 높은 활성을 보였 으며, 에탄올 추출물이 물 추출물에 비해 약간 더 높은 활성 을 보이는 것으로 확인되었다. 총 폴리페놀, 플라보노이드 함 량과 항산화력 사이의 상관관계를 확인한 결과는 모두 1% 유의수준에서 유의성이 있는 것으로 확인되었다.