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ISSN : 1225-4339(Print)
ISSN : 2287-4992(Online)
The Korean Journal of Food And Nutrition Vol.30 No.4 pp.728-734
DOI : https://doi.org/10.9799/ksfan.2017.30.4.728

Inhibitory Effects on Human Breast Cancer Cells Migration of Small Black Bean according to the Cooking Methods

Jihun Shin, Nami Joo†
Dept. of Food & Nutrition, Sookmyung Women’s University, Seoul 04310, Korea
Corresponding author: Nami Joo, Dept. of Food & Nutrition, Sookmyung Women’s University, Seoul 04310, Korea. +82-2-710-9471, +82-2-710-9479, jshinh@hanmail.net
20170516 20170626 20170629

Abstract

After being subjected to different cooking methods, small black beans (Rhynchosia nulubilis) were investigated in order to assess the effects of the retained bioactive compounds. Using uncooked, pan broiled, boiled, steamed, and pressure cooked beans, the inhibitory effects of MCF-7 cell migration were evaluated at protein concentrations of 40, 160, and 640 μm/mL, using the Boyden's chamber assay. All protein concentrations (40, 160, and 640 μm/mL) of pan broiled beans showed significant reduction (59.83, 32.48, and 21.37%, respectively) in the rate of cell migration to the lower chambers (p-value less than 0.001). Estimated cell migration rates correlated to the exponential decay between experimentally measured cell migration rates and converted samples. The range of estimated cell migration rate for each 100 mg/mL of cooked sample was as follows: pan broiled (21.16%), boiled (22.48%), steamed (22.48%), pressure cooked (29.52%), and uncooked (35.03%) beans. Our study indicated that selective modifications of cooking methods for small black beans, such as pan broiling, ameliorated the inhibitory effects of MCF-7 cell migration. This suggests that optimized cooking methods increase the nutritional contents of the cooked food.


조리방법을 달리한 쥐눈이콩의 인체유방암세포 이동성 억제 효과

신 지 훈, 주 나 미†
숙명여자대학교 식품영양학과

초록


    서 론

    쥐눈이콩(Rhynchosia nulubilis)은 서리태보다 작은 동아시 아 토착 품종(Yim 등 2009)으로 껍질에는 항산화 물질인 다 량의 polyphenol이 함유하는 것으로 나타났다(Sa 등 2003). 또 한 항산화 검정결과에서 국산 콩 13종류 중 쥐눈이콩과 속 피리가 높은 항산화력과 ROS 소거활성, DNA 산화적 손상 억제에도 효과가 있는 것으로 보고하였다(Choung 등 2001; Nam & Kang 2003). Shu 등(2009)은 콩 섭취와 유방암 예방과 의 유방암 발병 관계에 대한 연구를 통해 콩 단백질과 이소 플라본을 꾸준히 섭취한 여성의 유방암 재발률이 섭취량이 적은 여성에 비해 유의적으로 낮게 나타났다고 하였다.

    정상세포에서 세포 이동성(cell migration)은 태아 발달 과 상처부위의 조직 회복에 필수적이지만, 암세포 이동성은 인간의 정상적 인 생리 조절 기능의 역할과 달리 암 전이 (metastasis)를 촉진시킨다. 다른 암과 마찬가지로 유방암도 치료가 늦어지면 림프관과 혈류를 따라서 전이하여 심각한 결과를 초래하게 된다(Lee 등 2002). 본 연구는 유방암의 약 60%를 차지하는 MCF-7(Michigan Cancer Foundation-7), 호르 몬 의존형 세포 유방암 세포를 사용하였다. 일반적으로 알려 진 호르몬 의존형 유방암 치료제는 tamoxifen(TAM)으로 대 표적인 항에스트로겐(antiestrogen)제로 대표 약제(SERM: Selective Estrogen Receptor Modulator)이다. 그러나 이 약제를 장기 복용하는 환자들에게 부작용으로 색전 질환, 자궁 내막 암 또는 혈전을 일으키기도 한다고 하였다(Park 등 2003). 그 러므로 유방암 예방 및 치료에 관하여 식품을 이용한 phytochemical의 효과에 주목하고 있다. 그 예로 유방조직의 세포 증식이 상당히 일어나는 청소년기는 성인보다 발암성 손상 (carcinogenic insult)의 가능성이 높다. 그러나 이 시기에 콩을 꾸준히 섭취한 청소년들이 성인이 된 이후 콩을 섭취하지 않 은 청소년에 비해 유방암 발병률이 낮게 나타났다(Okasha 등 2003; Hankinson 등 2004).

    선행 연구(Shin & Joo 2016)에서 제시한 바와 같이 조리방 법을 달리한 쥐눈이콩에서 조리된 식품에 잔존하고 있는 생 리활성 물질의 함량 변화를 관찰할 수 있었으며, 이에 본 연 구는 쥐눈이콩을 이용하여 조리방법별 MCF-7 유방암 세포 의 이동성 억제를 통해 다양한 조리 방법 중에 생리활성 물질 의 잔존율이 높은 조리 방법을 제시하고자 하였다.

    재료 및 방법

    1.실험 재료

    재료는 강원도 정선[동트는 농가]에서 쥐눈이콩(Rhynchosia nulubilis)을 2012년에 구입하였으며, 실험 재료는 밀봉하여 냉장보관(4℃)하였다. 연구에 사용한 모든 쥐눈이콩은 동일 형태와 동일 색인 것으로 선별하여 실험 재료로 사용하였다.

    2.실험 디자인

    다수의 예비 실험을 통해 가정에서 주로 사용되는 볶기 (pan boiling), 삶기(boiling), 찌기(steaming), 압력 조리(pressure cooking)로 조리법을 선정한 후, 각각의 조리 방법을 최적화 하였다. 암세포 이동성 관찰은 Boyden's chamber assay로 실시 하였다. Tamoxifen은 MCF-7 세포에 대한 대표적인 항암제로 이를 negative control로 정하였고, IC50을 도출해 조리방법을 달리한 쥐눈이콩 시료간의 차이를 분석하였다.

    3.시료 제조

    쥐눈이콩 조리방법별 제조 공정은 조리 시간의 시간과 온 도를 Toda 등(2000)의 연구를 기초로 하여 반복적인 예비실 험을 통해 선정하였다(Fig. 1). 쥐눈이콩 생콩 70 g을 3회 세척 하여 물기를 제거하여 사용하였고, 시료의 제조는 induction cooktop(heating level No. 1~9, 210 mmΦ, 1,800 W, Miele KM 6200, Germany)에서 조리하였다. 조리과정에서 온도측정은 적외선 온도계(temperature range -40℃∼+280℃, IR 460, Food Master, IRtek, W.A. Australia)로 측정하였다. 각각의 시료는 -80℃에서 동결건조기(MCFD 8505, Ilshin Lab Co., Seoul, Korea)로 48시간 동결 건조시켜 분쇄(HB-310, Hibell Co., Seoul, Korea)하여 20 mesh(850 μm)에 내려 분말화한 후 polyethylene bag(Clean wrap Co., Kyungsangnam-do, Kimhae, Korea) 에 담아 -40℃에서 보관하여 시료로 사용하였다(Fig. 1).

    4.추출물제조 및 단백질 정량

    조리방법을 달리한 각각의 콩을 동결건조 후 분말화하 여 PBS(Phosphate Buffered Saline Solution)에 넣어 25℃에 서 6시간 동안 shaker로 섞어 준 후, 원심분리하여 상등액을 추출하였다. 예비 실험을 통해 세포에 직접적인 영향을 미 치지 않는 범위에서 각 추출물의 1%(v/v) DMSO(Dimethyl Sulfoxide)를 넣어 혼합하였다. 다시 0.45 μm 필터(Disposable menbrane filter, Advantec, Japan)에 내린 stock solution을 -40℃ 에서 냉동 보관하였다. 단백질 농도 측정에는 Bradford(Bio- Red Laboratories, CA. USA) assay를 실시하였다.

    5.세포 배양

    MCF-7 cells 호르몬 의존형 유방암 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Rockvill, MD, USA)에서 구입, 37℃, 5% CO2 환경에서 배양하였다. 세포 배양액은 DMEM에 10% (v/v) FBS(Fetal Bovine Serum), 1%(v/v) penicillin/streptomycin 을 혼합 제조하였고, 배지를 2일 간격으로 교체해 주었다.

    6.MCF-7 세포의 이동성

    암세포 전이에는 부착, 이동, 침윤 과정을 거치는데(Suh & Moon 1999), 암세포가 혈관이나 림프절로의 이동을 Boyden's chamber assay라는 방법을 통해 실험실 조건에서 암세포 이동 성을 측정하는 방법이다. 암세포는 microporous filter를 뚫고 유도물질 쪽으로 지나가려는 성질이 있어 MCF-7 세포를 cell culture inserts(upper chamber)에 처리하고, 암세포 유도 물질 (chemoattractant)을 lower chamber에 넣어 암세포가 유도물 질 쪽으로 이동하려는 성질을 이용해 세포 이동성을 관찰하 는 방법이다. Fig. 2의 A는 암세포의 혈관 이동성을 나타내는 것이며, B는 실험실 조건으로 도식화한 것이다. 본 실험은 Ford 등(2010)의 방법을 기초로 하여 Boyden's chamber assay 용 24 well plate를 사용하여 upper chamber인 cell culture inserts는 microporous filter size 8 μm pores(Falcon, NJ, USA)인 것으로 사용하였다. 쥐눈이콩 시료 추출물을 단백질 농도별 (40, 160, 640 μg/mL)로 제조하여 1×105 cells/300 μL의 세포에 처리하였다. 생콩은 positive control로, tamoxifen(IC50=15 μM) 은 negative control로 하여 조리방법별 쥐눈이콩의 세포 이동 성을 비교하였다. 시료별 쥐눈이콩 추출물의 농도 범위는 WST-1(Roche, Mannheim, Germany) 측정을 통해 MCF-7 세포 의 증식 범위를 측정하여(Kamonwan 등 2005) 시료 독성에 영 향을 받지 않는 쥐눈이콩 시료 추출물을 단백질 농도(0.25~ 640 μg/mL)범위에서 결정하였다. 본 실험에서 쥐눈이콩 시료 추출물의 농도 결정은 다수의 반복적인 예비 실험으로부터 시료에 의한 세포독성이 직접 세포에 영향을 미치지 않는 범 위에서 결정하였다. 대조군과 쥐눈이콩 시료가 처리된 세포 는 6시간 배양(37℃, 5% CO2 incubator) 이후, microporous filer (미세다공성 필터)를 통과한 암세포를 무작위로 촬영하여 3차원 이미지 해석 프로그램(IMARIS, Bitplane, UK)을 사용 해 각 샘플의 세포수를 도출하였고, 그 평균값을 이동률(cell migration, %)로 나타내었다. 세포 이동률 실험은 각 sample 당 5반복의 실험을 실시하였고, 한 실험 당 농도별 6회 반복 으로 결과를 도출하였다.

    7.통계 분석

    실험결과의 통계 처리는 IBM SPSS Statistics version 21 (SPSS Inc., Chicago, Illinois, USA) 프로그램을 사용하였다. MCF-7 세포 이동률 분석에는 ANOVA test를 실시하여 5% 이 내의 유의수준에서 각 시료의 유의성 검증과 유의적인 차이 는 Duncan's multiple range test로 통계적 유의성을 검증하고 자 하였다. 쥐눈이콩 량으로 환산하여 추정된 MCF-7 세포 이 동률을 도출하고자 OriginPro 8(OriginLab Co. USA)로 비선형 회귀분석을 통한 지수함수를 구하였다.

    결과 및 고찰

    1.MCF-7 세포 이동성 억제 효과

    암세포 전이과정에 평가도구의 하나로, 세포 이동성으로 확인할 수 있는 방법으로 쥐눈이콩 추출물을 암세포 유도 물질(10% FBS)에 처리하였을 때, 암세포 유도물질이 있는 쪽 으로 MCF-7 세포의 이동에서 조리방법을 달리한 쥐눈이콩 이 억제하는 효과가 있는지 관찰하고자 하였다. 선행 실험으 로 얻은 Negative control인 tamoxifen (IC50=15 μM)은 14.32± 1.61%의 세포 이동률을 보였다. 쥐눈이콩 각 시료들은 PBS 용액으로 추출 후 Bradford assay(Bradford MM 1976; Zor & Selinger 1996; Noble & Bailey 2009) 단백질 정량으로 설정된 단백질 농도 범위는 40, 160, 640 μg/mL이었다.

    조리 방법별 시료 추출물의 단백질 농도별로 MCF-7 세 포 처리에서 얻은 세포 이동률은 쥐눈이콩 추출물의 단백질 농도(40, 160, 640 μg/mL) 증가에 따라 유의적으로 감소하 는 경향을 나타내었다(Table 1, Fig 3). 쥐눈이콩 생콩 추출물 의 세포 이동률은 생콩 추출물의 단백질 농도(40, 160, 640 μg/mL)가 증가할수록 69.66±7.51, 57.69±0.01, 37.61±5.78%로 유의적으로 감소하는 차이를 보였다(p<0.001). 볶은 콩은 추출 물의 단백질 농도가 증가할수록 59.83±2.66, 32.48±4.50, 21.37± 3.22%로 세포 이동률이 유의적으로 감소하는 차이를 보였고 (p<0.001), 삶은 콩 추출물에 의한 세포 이동률도 유의적으로 61.54±11.39, 31.20±4.85, 27.78±2.96% 감소하였다(p< 0.01). 세 포 이동률은 증기로 찐 콩(64.96±9.70, 30.77±3.39, 23.93±5.18%) 과 압력 조리한 콩(55.98±7.29, 32.91±11.63, 29.91±2.96%)에서 도 단백질 추출물의 농도(40, 160, 640 μg/mL)가 증가할수록 감소하는 것으로 나타났다. 단백질 농도 범위에서 각각의 세 포 이동률은 유의적인 차이를 보였고, 콩 추출물의 농도가 증 가할수록 세포 이동이 감소하는 것으로 나타났다. 그 중 볶은 콩의 단백질 추출물의 농도가 증가할수록 다른 조리방법보 다 세포의 이동률이 크게 감소되어 암세포 전이에서 이동을 억제하는 것으로 볼 수 있었다. 일반적인 암세포의 전이는 세포가 matrix에 부착(attachment)되고, 단백질 분해과정이 일 어나 세포의 기질 및 기저막의 분해로 matrix를 통과해 림프 절이나 혈관으로 이동(migration)하여 암 세포가 다른 조직 이나 장으로 들어가 증식하게 된다(Li 등 2007, Pavese 등 2010). Bang & Kim(2006)은 curcumin을 인체 유방암 세포 (MDA-MB-231 cell)에 5 μM 이상에서 이동성이 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다고 한다. 콩 식품을 이용해 암세포 전이 억제를 연구한 Pavese 등(2010)은 genistein이 세포 이동 및 침윤, 전이과정 모두를 억제한다고 동물 실험과 임상실 험을 통해 보고하였다. 식품에 의한 암세포 전이 억제 효과에 대한 연구가 미비한 실정이며, 또한 그 결과에 대한 mechanism 에 대해서는 향후 연구에서 더 밝혀야 할 과제로 보고 있는 바이다.

    2.조리 방법별 쥐눈이콩 농도에 따른 MCF-7 세포 이동 률 비교

    쥐눈이콩 추출물의 단백질 농도를 실제 쥐눈이콩 함량 (mg/mL)으로 환산(Table 2)하여 조리 방법별로 세포 이동률 에 미치는 영향을 알아보고자 하였다.

    1)쥐눈이콩의 MCF-7 세포 이동률 비선형 회귀식 산출

    MCF-7 세포 이동률을 쥐눈이콩 함량으로 환산한 후 지수 감소함수(Exponential decay function)를 구해 비선형 회귀식 으로 산출하였다(Table 3). 이에 대한 지수 함수 그래프는 Fig. 4에 나타내었다. 분석결과로 추정 회귀식들과 실험을 통하여 측정된 세포 이동률 r2 값을 생콩(0.83788), 볶은 콩(0.97963), 삶은 콩(0.99999), 찐 콩(0.99994), 압력 조리한 콩(0.99852)으 로 나와 회귀곡선에 높은 적합도의 상관관계(Correlation with exponential decay)를 보였다. 조리 방법별 쥐눈이콩 100 mg/mL 에서 본 추정된 암세포 이동률은 생콩(35.03%), 압력 조리한 콩(29.52%), 찐 콩과 삶은 콩(22.48%), 볶은 콩(21.19%) 순서 로 이동률이 낮게 나타나다 그 이상의 농도에서 수렴하는 것 으로 나타났다. 쥐눈이콩 증가에 따른 변화를 지수함수 그래 프를 통해 생콩보다 쥐눈이 찐 콩과 볶은 콩에서 세포 이동률 이 낮게 나타나는 것을 확인할 수 있다(Fig. 4).

    즉, 암세포 이동률의 감소는 조리한 콩의 함량이 증가할수 록 나타났고, 일정 수준의 쥐눈이콩 농도에서는 이동률의 변 화가 더 이상 나타나지 않는 것으로 나타났다. 본 연구에서는 조리방법을 다르게 하였을 경우, 특히 볶은 콩 함량이 증가에 따라 다른 조리방법들보다 세포 이동률이 더 낮은 것으로 나 타나, 암 전이에 관여하는 암세포 이동억제 효과가 볶은 콩 조리에서 상대적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 콩의 세포 이동성에 대한 연구에서 Miekus 등(2007)은 쥐 전립선 암 세포에 genistein의 투여량 증가가 의존적으로 세포에 독성 을 비치지 않는 범위(1~10μM)에서 암세포 이동을 감소시키 는 것으로 나타났으며, 유사한 농도 범위에서 유방암 세포 와 흑색종 세포(melanoma cells)의 이동을 감소시킨다고 하였 다(Farina 등 2006). 이 연구는 genistein이 세포 이동성을 증가 시키는데 필요한 Y387에 FAK의 인산화를 억제한다는 연구 결과가 있다(Kyle 등 1997). 이와 같이 genistein은 세포 부착 과 세포 이동성에 FAK의 활성을 부분적으로 억제하는 효과 가 있는 것으로 알려져 있으나, 그러한 영향을 미치는 genistein 의 mechanism과 이러한 프로세스는 아직 밝혀지고 있지 않음 을 명시하고 있다(Pavese 등 2010).

    2)비선형 회귀식으로부터 도출된 쥐눈이콩 농도별 MCF-7 세포 이동률 비교

    쥐눈이콩 단백질 농도로부터 쥐눈이콩 함량을 계산한 값 으로 모든 콩 농도에서 세포 이동률을 추정해 보고자 비선형 회귀분석으로 비선형 회귀식(Table 3)을 도출하였고, 임의로 선정한 쥐눈이콩 함량을 이 회귀식에 대입하여 세포 이동률 을 구한 후 유의성을 검증하고자 하였다(Table 4).

    도출된 세포 이동률에서 압력 조리 콩(1.25, 2.5, 5 mg/mL) 이 다른 시료들보다 낮았고(p<0.001), 다른 조리법들에 비해 10 mg/mL에서 찐 콩이 27.77%로 상대적으로 낮았다(p<0.001). 쥐눈이콩 20 mg/mL에서는 볶은 콩을 제외한 생콩, 삶은 콩, 찐 콩, 압력 조리한 콩에서 세포 이동률은 더 이상 감소하지 않고 수렴하였고, 세포 이동률이 40, 80 mg/mL에서 볶은 콩 이 22.61, 21.19%로 감소하였다. 볶은 콩에서 세포 이동률 감 소가 가장 큰 것으로 나타나, 쥐눈이콩 볶은 조리가 암세포 이동성 억제에 효과가 높은 것으로 사료된다.

    요약 및 결론

    본 연구는 쥐눈이콩의 조리방법을 달리한 쥐눈이콩 시료 추출물 단백질 농도별 인체 유방암 세포(MCF-7 cells)의 이동 률 변화를 관찰하여 쥐눈이콩의 조리 이후에 식품에 잔존하 는 생리활성 물질이 많을 것으로 보이는 효과적인 조리 방 법을 찾고자 하였다. Boyden's chamber assay로 MCF-7 세포 의 이동률의 결과, 쥐눈이콩 생콩 추출물 단백질 농도(40, 160, 640 μg/mL)가 증가함에 따라 세포 이동률은 유의적으로 69.66%, 57.69%, 37.61%로 각각 감소하였고(p<0.01), 볶은 콩 에서는 59.83%, 32.48%, 21.37% 감소하였고(p<0.001), 삶은 콩(p<0.01), 찐 콩(p<0.01), 압력 조리한 콩(p<0.05) 모두 단백 질 농도 의존적으로 세포 이동률이 감소하였다. 비선형 회귀 분석을 통해 환산된 쥐눈이콩 함량을 기준으로 세포 이동률 을 추정한 결과, 실험을 통한 세포 이동률과 비선형 회귀분석 으로 도출된 지수감소함수 그래프에서 r2 값은 0.837~0.999로 모두 높은 상관관계를 나타내었다. 쥐눈이콩 량이 100 mg/mL 일 때, 세포 이동률은 생콩(35.03%), 압력 조리한 콩(29.52%), 찐 콩과 삶은 콩(22.48%), 볶은 콩(21.16%)의 순서로 나타나, 볶은 콩에서 세포 이동률이 가장 낮게 나타났다.

    본 연구를 통하여 조리 방법을 달리한 쥐눈이콩은 MCF-7 세포 이동에 억제 효과가 있음을 알 수 있었다. 볶은 콩에서 MCF-7 세포 이동 억제에 탁월한 효과가 나타나는 것을 확 인할 수 있었다. 따라서 콩으로부터 조리 후 생리활성 물질을 많이 섭취하기 위해서는 건열 조리의 경우, 볶는 조리법으로 가루를 내어 식품의 조리에 이용하는 것이 바람직하다고 사 료된다.

    Figure

    KSFAN-30-728_F1.gif
    Cooking method flow diagram of small black bean (Rhynchosia nulubilis).
    KSFAN-30-728_F2.gif
    Schematic representation of the chambers used in the migration assay.

    A) A schematic showing how cancer cells migrate from the primary tumor to the blood circulation.B) A schematic of Boyden's chamber assay.

    KSFAN-30-728_F3.gif
    Decreasing MCF-7 cell migration rate according to the protein concentrations of small black bean (Rhynchosia nulubilis).

    TAM as a negative control inhibits MCF- 7 cell migration with an IC50 of 15 μM(14.32±1.61%).

    KSFAN-30-728_F4.gif
    Estimated formulas of MCF-7 cell migration rates of small black bean (Rhynchosia nulubilis).

    *SBB; small black bean.

    Table

    MCF-7 cell migration rate of small black bean (Rhynchosia nulubilis) Mean±S.D.
    1)SBB: Small Black Bean (Rhynchosia nulubilis).
    2)a,~c means in a row followed concentration by different superscripts are significantly different(p<0.01) by Duncan's multiple range test.
    3)*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
    Quantity calculation of small black bean (Rhynchosia nulubilis) from protein concentrations
    1)SBB; small black bean (Rhynchosia nulubilis).
    Exponential decay function of MCF-7 cell migration rates for small black bean (Rhynchosia nulubilis)
    1)SBB: Small Black Bean (Rhynchosia nulubilis).
    Estimated MCF-7 cell migration rates of small black bean (Rhynchosia nulubilis)
    1)Cell migration (%), SBB; small black bean (Rhynchosia nulubilis).
    a~dmeans in a row followed by different superscripts are sigmificantly different(p<0.001) by Duncan's multiple range test.
    ***p<0.001.

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